|
|
Membránové vlastnosti gliových buněk po ischemii in vivo
Pivoňková, Helena ; Anděrová, Miroslava (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
V rámci své dizertační práce jsem měla za cíl charakterizovat membránové vlastnosti astrocytů a NG2 glií během akutní a chronické fáze ischemického poškození centrální nervové soustavy se zaměřením na expresi a aktivitu K+ iontových kanálů. Pro experimenty jsme použili dva modely ischemie u potkanů - globální mozkovou ischemii, která způsobuje selektivní poškození neuronů a vznik astrogliózy v CA1 oblasti hipokampu, a inkubaci míšního segmentu v roztoku se zvýšenou koncentrací K+. Zjistili jsme, že hipokampální astrocyty jsou od třetího dne po ischemii 4 depolarizované a 1 měsíc po ischemii vykazují vyšší podíl dovnitř usměrněných proudů. Exprese Kir4.1 kanálů byla snížena od třetího dne po ischemii, zatímco exprese Kir2.1, Kir5.1 a TREK1 kanálů byla silně zvýšena u reaktivních astrocytů 1 měsíc po ischemii. U NG2 glií jsme zjistili signifikantní zvýšení vně usměrněných zpožděných a A-typu K+ (KDR a KA) proudů 2 hodiny a 3 dni po ischemii a snížení dovnitř usměrněných K+ proudů 3 dni po ischemii, což je typické pro proliferující buňky. Komplexní astrocyty v míše vystavené zvýšené koncentraci K+ vykazovaly větší změny ve srovnání s dalšími druhy astrocytů, tzn detekovali jsme u nich zvýšení KDR and KA proudů. Navíc, inkubace míchy v roztoku se zvýšenou koncentrací K+ vedla ke změnám v objemové regulaci u...
|
|
| |
|
| |
|
|
Modulace synaptického přenosu nociceptivní signalizace v zadním rohu míšním
Špicarová, Diana ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Vlachová, Viktorie (oponent) ; Rokyta, Richard (oponent)
6 SOUHRN Patologické bolestivé stavy spojené s různými onemocněními nebo poraněním tkáně jsou doprovázeny zvýšenou citlivostí k podnětům. Tato hypersenzitivita je podmíněna zejména periferní senzitizací nociceptorů a centrální senzitizací v míše. Jedním ze stěžejních procesů probíhajících při centrální senzitizaci je modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním. Studie zahrnuté v této dizertaci se zabývaly možnostmi regulace synaptické účinnosti prostřednictvím cytokinu TNFα, inzulinu a agonisty TRPV1 receptorů N-oleoyldopaminu (OLDA). Tyto tři látky jsou syntetizovány v CNS, přitom produkce TNFα v míše je spojena zejména s neuropatiemi. TNFα a inzulin mají potenciál modulovat synaptický přenos. Endogenní agonista TRPV1 receptorů OLDA může aktivovat míšní TRPV1 receptory, které jsou v drtivé většině exprimovány na centrálních zakončeních nociceptivních neuronů spinálních ganglií. TRPV1 receptory jsou známy jako integrátory nociceptivních podnětů především z výzkumu periferních receptorů na nociceptorech, které mohou být senzitizovány pomocí mediátorů zánětu a aktivovány zvýšením teploty nebo snížením pH, což v míše není pravděpodobné. S využitím techniky terčíkového zámku byly snímány miniaturní nebo evokované excitační postsynaptické proudy (EPSC) na neuronech v superficiální oblasti zadního rohu...
|
|
|
Úloha konzervovaných aminokyselinových zbytků v S4/S4-S5 oblasti vaniloidních TRP receptorů
Boukalová, Štěpána ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Doležal, Vladimír (oponent)
TRPV1 receptor, iontový kanál z podrodiny vaniloidních TRP receptorů, je tetramerní proteinový komplex, jehož každá podjednotka obsahuje šest transmembránových segmentů S1-S6. Tento receptor je aktivován řadou podnětů schopných vyvolat bolest, jako jsou kapsaicin, protony, zvýšená teplota okolního prostředí a depolarizační napětí. Mechanizmus napěťové citlivosti TRPV1 receptoru není doposud znám. Předpokládá se, že součást napěťového senzoru tvoří nabité aminokyselinové zbytky v S4 transmembránovém segmentu a v S4-S5 spojovací kličce. Abychom určili, která rezidua se podílejí na napěťové citlivosti TRPV1 receptoru a příbuzných vaniloidních receptorů, vytvořili jsme mutantní formy těchto iontových kanálů se zaměněnými konzervovanými aminokyselinovými zbytky v S4/S4-S5 oblasti. Velká část námi vytvořených mutantních TRPV1 receptorů byla poškozena vzhledem k napěťové, chemické a/nebo teplotní aktivaci. Lokalizovali jsme dvě rezidua (R557 a D576), která by potenciálně mohla tvořit součást napěťového senzoru TRPV1. Prokázali jsme funkční interakci dvojic reziduí R557-E570 a D576-R579 u TRPV1 receptoru. Určili jsme aminokyselinový zbytek (K571), který specificky podmiňuje citlivost TRPV1 k 2aminoetoxydifenylborátu (2APB), společnému aktivátoru TRPV1, TRPV2 a TRPV3 iontových kanálů. I přes vysokou konzervovanost...
|
|
|
Mechanizmy aktivace a modulace TRPV1 receptoru: vztah struktury a funkce
Touška, Filip ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Vaniloidní receptor typu 1 - TRPV1 - je jedním z významných iontových kanálů z rodiny teplotně aktivovaných TRP receptorů, které se podílejí na integračních mechanizmech transdukce nociceptivních signálů v periferním nervovém systému. Na primárních aferentních senzorických neuronech je TRPV1 aktivován podněty chemickými (např: kapsaicin, reziniferatoxin, mediátory zánětu, endogenní vaniloidy, snížení pH < 6.5) a teplotními (nad 43 řC). Kromě zvýšené exprese na neuronech ganglií zadních kořenů míšních a trigeminálních gangliích byla potvrzena funkční exprese TRPV1 receptoru také v některých vyšších strukturách CNS. Strukturálně-funkční studie v průběhu posledních 13 let, které uplynuly od naklonování tohoto polymodálního iontového kanálu, odhalily řadu specifických vlastností, zůstává však také mnoho nezodpovězených otázek, převážně týkajících se buněčných mechanizmů regulace aktivity, modulace a komplexní funkce v nervovém systému. Cílem diplomové práce bylo pomocí elektrofyziologických a fluorescenčních technik charakterizovat časový průběh aktivace a desenzitizace rekombinantního TRPV1 receptoru ve vztahu k dynamickým změnám intracelulární koncentrace Ca2+. Na základě toho stanovit protokol a hlavní parametry těchto dějů, na které se zaměřila následná strukturálně-funkční analýza. Jedním z hlavních úkolů...
|
|
|
Vaniloidní receptor TRPV1 v mechanizmech akutní bolesti
Nováková, Karolina ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Kozák, Jiří (oponent) ; Rokyta, Richard (oponent) ; Kršiak, Miloslav (oponent)
Jedním z významných objevů, jež v posledním desetiletí ovlivnily nové směry výzkumu mechanizmů nocicepce a bolesti, byla molekulární identifikace vaniloidního receptoru TRPV1. Tento membránový protein je převážně exprimován na periferních zakončeních některých nemyelinizovaných a slabě myelinizovaných primárních aferentních vláken, v jejichž plazmatických membránách vytváří neselektivní kationtové kanály, které lze specificky aktivovat kapsaicinem, zvýšením teploty překračující fyziologický práh 43 řC a slabými kyselinami. Aktivita TRPV1 receptoru, jehož fyziologická úloha byla prokázána především v souvislosti se vznikem tepelné hyperalgezie, se významně zvyšuje v přítomnosti mediátorů zánětu (bradykinin, serotonin, prostaglandin aj.). Přestože je molekulární struktura TRPV1 známa již od roku 1997, jsou v současné době zatím popsány jen některé mechanizmy, které se uplatňují v procesech jeho aktivace a senzitizace. Tyto poznatky zatím vedly k vývoji sofistikovaných ligandů strukturálně příbuzných kapsaicinu, látky, která je již odnepaměti využívána k léčbě některých bolestivých stavů. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Vztah struktury a funkce teplotně aktivovaných TRP iontových kanálů a jejich úloha v mechanizmech
Benedikt, Jan ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Kršiak, Miloslav (oponent) ; Blahoš, Jaroslav (oponent)
Výzkum v oblasti senzorické fyziologie byl významně ovlivněn molekulární identifikací členů transient receptor potential (TRP) rodiny iontových kanálů, jež umožnila detailní studium vztahu funkce a struktury této unikátní rodiny membránových receptorů. Exprese TRP iontových kanálů na senzorických neuronech, ale zřejmě také v keratinocytech, umožňuje organizmu přesnou a rychlou detekci škodlivých tepelných a chemických podnětů a přenos signálu do vyšších nervových struktur. Přes velké úsilí vkládané do poznání strukturních a funkčních vztahů rodiny neselektivních kationtových TRP kanálů, neexistuje v dnešní době všeobecná hypotéza, která by vysvětlovala mechanizmus tepelné či chemické aktivace těchto receptorů na molekulární úrovni. Předložená dizertační práce uvádí nové výsledky týkající se molekulární podstaty akutní desenzitizace vaniloidního receptoru TRPV1 a pokouší se uvést tyto poznatky do souvislosti se současnými představami o působení vaniloidních látek na polymodálních nociceptorech. Zabývá se také určením molekulárního mechanizmu, kterým je zprostředkována etanolová inhibice mentolového receptoru TRPM8 a diskutuje možný fyziologický význam tohoto procesu. Tato práce také předkládá výsledky funkčního mapování oblasti šesté transmembránové domény ankyrinového receptoru TRPA1 a identifikuje několik...
|
|
| |
|
|
Struktura funkce vaniloidního receptoru TRPV1
Sušánková, Klára ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Kršiak, Miloslav (oponent) ; Chvátal, Alexandr (oponent)
ZAVER S využitím elektrofyziologické techniky "patch clamp" jsme zjistili, že redukční a oxidační látky senzitizují aktivaci teplem u vaniloidního receptoru. Pomocí cílené mutageneze jsme určili cystein 621, který se významně podílí na potenciaci odpovědí vyvolaných teplem působením redukční látky dithiothreitol. Ukázali jsme, že extracelulární cysteiny (C616, C621 a C634) TRPV1 receptoru se neúčastní senzitizace odpovědí na teplo vlivem oxidačních látek. Pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie jsme prokázali, že oxidační látky ovlivňují koncentraci agonistů TRPV1 receptoru. Prokázali jsme, že oxidační komplex 1,10-fenantrolinu s měďnatými kationty (Cu:Phe) je blokátorem TRPV1 iontového kanálu. Inhibiční účinek Cu:Phe je vratný, koncentračně a napěťově závislý a není zprostředkován extracelulárními cysteiny. Ukázali jsme, že Cu:Phe blokuje i příbuzný iontový kanál TRPM8. Pomocí analýzy funkčních vlastností C-zkrácených variant TRPVI receptoru ahomologního modelu jsme popsali úlohu C-konce vaniloidního receptoru. Ukázali jsme, že se zkracující se C-terminálou TRPV1 receptoru klesají amplitudy membránových proudů vyvolaných aplikací všech testovaných podnětů (kapsaicin, snížené pH, depolarizační napětí a bolestivé teplo). Odstranění 31 aminokyselin vedlo významnému snížení teplotního prahu aktivace,...
|
host ::
RSS.