|
|
Cytoplasmic membrane of Bacillus subtilis Regulation of the physical parameters
Beranová, Jana ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Bacillus subtilis, modelová Gram-pozitivní bakterie, uplatňuje při adaptaci své membrány k nízkým teplotám dva odlišné mechanismy: 1) Při dlouhodobé adaptaci k nižším teplotám dochází ke zvýšení poměru anteiso/iso-větvených mastných kyselin v membránových lipidech. 2) Po náhlém poklesu teploty je indukována syntéza desaturázy (Des), proteinu, který v aerobních podmínkách desaturuje řetězce mastných kyselin v lipidech cytoplazmatické membrány. Transkripce genu des, kódujícího desaturázu mastných kyselin, je indukována zvýšením uspořádanosti membrány. Pro indukci transkripce genu des je nezbytná účast dvoukomponentového systému DesK-DesR. V této práci jsem sledovala, jak kultivační podmínky ovlivňují mechanismus adaptace membrány B. subtilis k nízkým teplotám. Použity byly metody fluorescenční spektroskopie, analýza mastných kyselin, diferenciální skenovací kalorimetrie a metody molekulární biologie. V první části práce jsem se zabývala vlivem složení kultivačního media na chemické složení a biofyzikální parametry cytoplazmatické membrány B. subtilis během růstu v optimální (40 řC) a suboptimální (20 řC) teplotě. Srovnávala jsem komplexní medium s glukózou bohaté na živiny a dvě média minerální obsahující buď glukózu nebo glycerol jako zdroj uhlíku. Získaná data jasně ukazují zásadní vliv složení...
|
|
| |
|
|
Regulace vnitřního pH kvasinek - vliv vybraných transportních proteinů
Zalom, Peter ; Chaloupka, Roman (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Intracelulární pH ovlivňuje téměř všechny biochemické procesy v kvasinkách. Regulace cytosolického pH zahrnuje funkci mnoha transportních proteinů. Vliv vybraných sodných transportérů na cytosolcké pH byl zkoumán u dvou druhů kvasinek: Saccharomyces cerevisiae a Zygosaccharomyces rouxii včetně divokých kmenů a mutantů s ovlyvněným transportem sodíku. Měření cytosolického pH a pufrační kapacity bylo provedeno za použití fluorescenční sondy pHluorin - pH citlivého derivátu zeleného fluorescenčního proteínu. Bylo porovnáno několik postupů pro kalibraci fluorescenční odezvy pHluorinu na cytozolické pH. Byla prokázána důležitost korekce pro získaní správnych kalibračních křivkek . Bylo zjisteno, že cytosolické pH je ovlivněno transportním proteinem Nha1 jak v S. cerevisiae tak i v Z. Rouxii, ale ne transportérem Sod2-22 přítomným v Z. rouxii. Bylo prokázáno, že pufrační kapacita cytosolu klesá v přítomnosti glukózy ve všech studovaných kmenech.
|
|
| |
|
|
Studium průniku oligonukleotidů skrz liposomální membránu
Nováková, Jana ; Kočišová, Eva (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Modifikované oligonukleotidy, krátké úseky nukleové kyseliny, se staly potenciálními léčivy virových, nádorových či geneticky podmíněných onemocnění. Účinné použití modifikovaných oligonukleotidů vyžaduje jejich efektivní průnik skrz buněčnou membránu dovnitř buňky. V diplomové práci byly využívány liposomy, syntetické váčky tvořené dvojitou lipidovou vrstvou, jako modelový systém ke studiu interakce lipidu s komplexem homooligonukleotidu dT15 a kationického porfyrinu CuTMPyP4 za použití Ramanovy spektroskopie. Měření Ramanových spekter bylo prováděno na integrovaném Ramanově konfokálním mikrospektrofotometru a to jednak z roztoku na podložním sklíčku a jednak za použití speciální techniky kapkově nanášených povlaků (DCDR). Byl optimalizován proces výroby liposomů a přípravy vzorků pro měření spekter. Experimentální data byla zpracována faktorovou analýzou za využití algoritmu SVD (singular value decomposition). Bylo pozorováno, že při interakci oligonukleotidu s porfyrinem dochází k nárůstu signálu způsobeného fluorescencí. V naměřených Ramanových spektrech komplexu oligonukleotidu s porfyrinem dominují pásy, které přísluší vibracím porfyrinu. Ve spektrech komplexu s liposomy je možné pozorovat příspěvek valenčních vibrací vodíků řetězců mastných kyselin lipidu. Pozorované spektrální změny ukazují na...
|
|
| |
|
|
Sledování úhlových a časových charakteristik suspenzích systémů pomocí elastického rozptylu světla
Peikertová, Pavlína ; Kočišová, Eva (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Elastický rozptyl představuje poměrně jednoduchou a neinvazivní techniku, kterou je možno získat úhlové závislosti intenzit rozptýleného záření obsahující důležité informace o objektech, na nichž dochází k rozptylu. Získaná data v rámci této diplomové práce byla naměřena upraveným počítačem řízeným přístrojem "Photo-gonio-diffusometre model 42.000". Aparatura byla dále inovována pro experimenty se vzorky o malém objemu. Byly proměřeny jak modelové systémy, polymerní a latexové suspenze, tak i reálné systémy, tvořené suspenzemi liposomů o různých velikostech. Z experimentálních dat byl proveden odhad velikostí metodou Guinierova diagramu. Odhadnuté velikosti modelových systémů se velmi dobře shodují s jejich definovanými hodnotami. U liposomálních suspenzí nastala také poměrně dobrá shoda s předpokládanými hodnotami. Pro stříbrný borohydridový koloid byl sledován průběh jeho agregace a následná sedimentace po přidání porfyrinu CuTMPyP4. Naměřené úhlové a časové závislosti byly zpracovány faktorovou analýzou, která dokáže oba tyto procesy od sebe kvalitativně a časově oddělit.
|
|
| |
|
|
Vnitřní pH kvasinek a vliv transportu draselných iontů na jeho regulaci
Hošková, Barbora ; Urbánková, Eva (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Cytosolické pH kvasinek je regulováno a udržováno na stálé hodnotě součinností mnoha transportních proteinů. V této diplomové práci bylo využito fluorescenčního proteinu pHluorinu citlivého k pH okolí pro studium cytosolického pH v Saccharomyces cerevisiae. Většina měření byla prováděna na spektrofluorimetru, ale pro možné budoucí měření byla optimalizována i metoda měření na readeru (možnost měřit více vzorků zároveň) a bylo využito arginin-fosfátového kultivačního média. Zprostředkovaně byl sledován vliv konkrétních delecí proteinů na regulaci a stabilitu pH cytosolu. Některé proteiny s regulací cytosolického pH souvisí přímo, jako např. Pma1 - H+-ATPáza, jiné nepřímo - např. Ypt6. Bylo prokázáno, že samotná hodnota pHcyt závisí nejen na použitém kmeni kvasinek, ale i na kultivačních a experimentálních podmínkách. Žádná ze studovaných delecí neovlivnila regulaci pH výrazně, buňky si zachovaly schopnost regulace i v případě okyselení vnějšího prostředí kyselinou sírovou. Pufrační kapacita, měřená metodou přidání slabé zásady k suspenzi buněk, se pohybovala v rozmezí 30 - 60 mM v případě kultivace buněk v YNB médiu. Při kultivaci v AP médiu byla pufrační kapacita větší.
|
|
|
Studium transportních proteinů z rodiny Nramp
Surá, Lucie ; Chaloupka, Roman (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
The Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins (Nramp) form functionally conserved family of proton-dependent divalent metal ion transporters. In the present study, we investigated transport properties of a prokaryotic Nramp homolog - MntH transporter from Escherichia coli. H+ transport mediated by MntH was monitored in a bacterial model system using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin). Our experimental conditions enabled us to observe an uncoupled H+ transport mediated by MntH. Uncoupled H+ flux had been previously described in eukaryotic Nramp proteins, nevertheless this is the first observation of this phenomenon in a prokaryotic homolog. We demonstrated that the uncoupled H+ transport is pH- and temperature- dependent. The uncoupled transport H+ is also affected by specific single-point mutations at functionally important residues Asp34, His211 and Asn401. The second part of the work focused on effect of different ions, which are not MntH substrates, on transport properties of MntH. It was shown that addition of excess calcium or magnesium resulted in increase of H+ transport induced by divalent metal ions, but on the other hand our data suggest that calcium inhibits uncoupled H+ transport.
|
host ::
RSS.