|
|
Dědičné poruchy glykosylace: metody analýzy glykanů.
Bittenglová, Kateřina ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Veselá, Kateřina (oponent)
Dědičné poruchy glykosylace (CDG) představují skupinu více než 100 typů metabolických onemocnění, jejich příčinou jsou poruchy v syntéze a úpravě glykokonjugátů. Důsledkem je rozsáhlé spektrum klinických projevů, od poruch nervové soustavy po obtíže soustavy trávicí a vylučovací. Rozpoznat, o který konkrétní typ CDG se jedná, by nebylo možné bez celého spektra biochemických a molekulárně-genetických metod. Cílem této bakalářské práce bylo v teoretické části představit nejčastěji využívané metody k analýze oligosacharidového řetězce, který je součástí glykosylovaných proteinů nebo lipidů. Základem jsou tzv. "screeningové" metody, jako je např. isoelektrická fokusace vybraných glykoproteinů krevního séra transferinu a apolipoproteinu CIII. V rámci různých nadstavbových metod se provádí další analýzy, jako měření enzymové aktivity, hmotnostní spektroskopie, analýza PDO (oligosacharidy vázané na protein) a LLO (oligosacharidy vázané na lipid) a HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) a CZE (kapilární zónová elektroforéza). Při určení finální diagnosy je vždy prováděna i molekulární diagnostika, která potvrzuje přítomnost mutací v konkrétním genu. Cílem praktické části bakalářské práce bylo provést v rámci pilotního experimentu analýzu exprese genů pro OGA (N-acetylglukosaminasy) a OGT...
|
|
| |
|
|
Úloha systému oxidas se smíšenou funkcí s cytochromem P450 v metabolismu léčiv a karcinogenů
Mrízová, Iveta ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Levová, Kateřina (oponent) ; Hansíková, Hana (oponent)
5 Abstrakt Ellipticin (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]karbazol) je rostlinný alkaloid čeledi Apocynaceae, který vykazuje významnou protinádorovou a anti-HIV aktivitu. Jeden z mechanismů účinku tohoto protinádorového léčiva je, že se po enzymové aktivaci kovalentně váže na DNA a vytváří tak adukty s DNA. Enzymy, které se podílí na této aktivaci, patří mezi cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy. V disertační práci byl sledován vliv ellipticinu na expresi a aktivitu jednotlivých složek mikrosomálního monooxygenasového systému v různých tkáních laboratorního potkana. Současně byl sledován vliv ellipticinu a míra jeho cytotoxicity na různé nádorové buněčné linie. Součástí disertační práce byla i příprava anti-peptidové protilátky proti "orfánovému" cytochromu P450 2S1, který je exprimován zejména v nádorových tkáních epiteliálního původu. Pro lepší poznání jak může CYP2S1 participovat na metabolismu cizorodých látek, byl tento protein připraven heterologní expresí v E. coli a byla analyzována jeho úloha v metabolismu ellipticinu, karcinogenního benzo[a]pyrenu (BaP) a jeho derivátu BaP-7,8-dihydrodiolu. Za využití myšího modelu byl studován vliv zánětu plic na metabolismus zmíněného environmentálního karcinogenu. Výsledky získané v disertační práci plně prokazují, že ellipticin indukuje potkaní cytochromy CYP1A1/2,...
|
|
|
Biochemical and molecular studies of the congenital disorders of glycosylation
Ondrušková, Nina ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Hřebíček, Martin (oponent)
Dědičné poruchy glykosylace (Congenital disorders of glycosylation, CDG) jsou rychle rostoucí skupinou vzácných dědičných metabolických poruch s prevalencí až 1:20 000, které jsou zapříčiněny genetickými defekty narušujícími proces glykosylace, tj. enzymatického připojení specifické sacharidové struktury na kostru proteinů nebo lipidů. Kvůli nespecifitě a variabilitě klinických příznaků u pacientů je určení diagnózy CDG velmi složité, a významně se spoléhá na správnou biochemickou a genetickou analýzu. Záměrem předložené dizertační práce bylo studium CDG na biochemické a molekulárně-genetické úrovni v rámci České a Slovenské republiky, které zahrnovalo tři specifické cíle: A.) zavést a optimalizovat laboratorní screeningové metody pro detekci CDG u klinicky suspektních pacientů, B.) určit odpovídající genetický defekt u pozitivních pacientů zachycených pomocí screeningu a studovat patobiochemické aspekty jednotlivých typů CDG na buněčné úrovni, a C.) analyzovat poruchy glykosylace s jinou (non-CDG) etiologií. Mezi přínosy této práce patří optimalizace isoelektrické fokusace apolipoproteinu C-III (ApoC-III) jako metody pro detekci abnormální O-glykosylace, a také popis praktických implikací metod pro screening CDG (např. detekce specifického polymorfizmu transferinu, u kterého nelze screening CDG...
|
|
|
Působení biguanidů na metabolizmus jater
Švecová, Eliška ; Kalous, Martin (vedoucí práce) ; Flachs, Pavel (oponent) ; Hansíková, Hana (oponent)
Již od středověku se k léčbě některých příznaků provázejících diabetes mellitus, používal extrakt z jestřabiny lékařské (Galega officinalis), která obsahuje derivát guanidinu galegin. Pozitivní účinky léčby však byly často převáženy množstvím negativních vedlejších efektů, které mohly vést až k úmrtí pacienta. Guanidin byl posléze nahrazen syntetickými deriváty biguanidy se sníženou toxicitou. Do klinických studií byly zařazeny pouze tři: metformin (N,N-dimetylbiguanid), fenformin (fenyletylbiguanid) a buformin (butylbiguanid), přičemž buformin a fenformin byly postupně z klinického použití staženy kvůli závažnému riziku laktátové acidózy. Méně toxický metformin je v léčbě diabetu 2. typu široce využíván do současnosti a je označován jako lék prvé volby. V současnosti se pozornost opět obrací i k fenforminu, zejména v souvislosti s potenciálním využitím biguanidů jako kancerostatik i jako k vhodnému modelu pro experimentální studium účinku biguanidů. Navzdory dlouhodobému klinickému využití není mechanizmus působení biguanidů dosud plně objasněn. V současné době je obecně přijímána teorie, že hlavní příčinnou hypoglykemického účinku metforminu je inhibice glukoneogeneze v játrech, známy jsou však také jeho účinky na hnědou a bílou tukovou tkáň, svaly nebo protektivní vliv na srdce. Ještě menší shoda panuje...
|
|
|
Dědičné poruchy glykosylace: alfa-dystroglykanopatie
Zdražilová, Lucie ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Alfa-dystroglykanopatie jsou autosomálně recesivně dědičná onemocnění patřící zároveň do skupiny dědičných svalových dystrofií a dědičných poruch glykosylace. V současné době je známo 20 genů, jejichž mutace vedou k tomuto onemocnění. Alfa-dystroglykan je membránový protein, který je posttranslačně modifikován pomocí oligosacharidových řetězců O-glykosidově vázaných přes mannosu. Porucha biosyntézy těchto oligosacharidových řetězců vede k hypoglykosylaci alfa-dystroglykanu, který tak ztrácí schopnost vázat se na lamininové G-domény ligandů extracelulárního matrixu. Tato hypoglykosylace pak vede přímo k nemocím nazývaným alfa-dystroglykanopatie. Nejvážnější formy alfa-dystroglykanopatíí se projevují svalovou dystrofií, oční malformací a poškozením centrální nervové soustavy. Mírnější formy poruchy se mohou projevovat pouze svalovou dystrofií bez dalších klinických příznaků. Diagnostika alfa-dystroglykanopatií je obtížná z důvodu nedostatečné palety biochemických metod, které by usnadnily zacílení vyšetřovacího procesu před molekulárně-genetickou analýzou. Cílem předkládané práce bylo podat přehled o alfa-dystroglykanopatiích se zaměřením na strukturu, úpravu a patologii alfa-dystroglykanu. V experimentální části této práce bylo otestováno použití imunoelektroforetických technik k diagnostické...
|
|
|
Studium interakcí doplňků stravy s enzymy biotransformace xenobiotik
Bebová, Michaela ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Hansíková, Hana (oponent)
V poslední době se věnuje stále větší pozornost chemopreventivním sloučeninám a to zejména fytochemikáliím, které jsou všeobecně považovány za zdraví prospěšné látky a to hlavně díky jejich přírodnímu původu. Velkou skupinu fytochemikálií představují flavonoidy, které jsou obsaženy v mnoha potravních doplňcích. Spotřeba těchto koncentrovaných zdrojů flavonoidů se v posledních letech dramaticky zvýšila. Užívání flavonoidních látek ve velkém množství však může být spojeno s některými nežádoucími účinky. Některé flavonoidy jsou známé modulátory enzymů I. a II. fáze biotransformace xenobiotik a jejich indukce může vést ke zvýšení aktivace karcinogenů. V rámci této diplomové práce byly zkoumány účinky vybraných flavonoidních sloučenin -naftoflavonu, -naftoflavonu, myricetinu a dihydromyricetinu a karcinogenů (BaP, PhIP) na enzymy II. fáze biotransformace, sulfotransferasy (SULT). Pro stanovení indukčního efektu byly připraveny protilátky pro jejich imunodetekci. Peptidické imunogeny, které byly vybrány z proteinových sekvencí potkaních sulfotransferas rSULT1A1, 1B1, 1C1, 1C2, 1C1/2, 1E1 a 2A1 byly použity ve formě KLH konjugátů pro imunizaci slepic za účelem získání antipeptidových protilátek (IgY) z vaječných žloutků. Frakce jednotlivých IgY byly izolovány jednoduchou extrakcí a následným vysrážením...
|
|
|
Exprese vybraných defektů oxidativní fosforylace na úrovni kultivovaných fibroblastů.
Marková, Michaela ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
AAbbssttrraakktt:: Savčí organismus je zcela závislý na produkci ATP systémem oxidativní fosforylace (OXPHOS) na vnitřní mitochondriální membráně. OXPHOS se skládá z komplexů I-IV dýchacího řetězce, ATP syntázy a součástí jsou také 2 elektronové přenašeče cytochrom c a koenzym Q. Poruchy mitochondriálního energetického metabolismu způsobené defekty OXPHOS jsou charakteristické extrémní heterogenitou klinických příznaků, variabilitou postižených tkání a také tíží defektu na úrovni jednotlivé tkáně. Ne vždy jsou poruchy jasně vyjádřeny na úrovni dostupných tkání či nejsnáze dosažitelných kultivovaných fibroblastů a/nebo zatím dostupnými metodami nejsme schopni tyto defekty na úrovni fibroblastů zachytit. Cílem diplomové práce bylo pomocí biochemických metod, zejména vysoce citlivé polarografie, identifikovat poruchy OXPHOS na úrovni kultivovaných fibroblastů a charakterizovat jejich funkční dopad na mitochondriální energetický metabolismus jako celek. Biologickým materiálem bylo 10 linií kultivovaných kožních fibroblastů od pacientů s izolovanými (SURF1, SCO2, ND1, ND5) nebo kombinovanými poruchami komplexů OXPHOS, jejichž biochemický defekt byl potvrzen ve svalové tkáni a také od 14 pacientů s mitochondriální dysfunkcí sekundárního charakteru (8 pacientů s Huntingtonovou chorobou, 6 pacientů s poruchou...
|
|
|
Studium poruch NADH: ubichinon oxidoreduktázy u člověka
Rodinová, Marie ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Kalous, Martin (oponent)
NADH: ubichinon oxidoreduktáza (komplex I) je nejkomplikovanějším enzymem mitochondriálního systému oxidativní fosforylace (OXPHOS). Komplex I leží na vnitřní membráně mitochondrií a je tvořen 45 podjednotkami, z nichž 7 je kódováno mitochondriální DNA a 38 jadernou DNA. Komplex I reoxiduje NADH a transportuje protony z matrix do mezimembránového prostoru, čímž pomáhá v syntéze ATP. Mitochondriální onemocnění způsobená poruchou komplexu I jsou nejčastější příčinou poškození systému oxidativní fosforylace. Projevují se heterogenní škálou symptomů a nejvýrazněji postihují energeticky náročné tkáně. Cílem diplomové práce bylo na kultivovaných fibroblastech co nejlépe charakterizovat dopady poruch komplexu I na metabolismus buňky. Studie byla provedena na dvou liniích fibroblastů získaných po informovaném souhlasu od pacientů s izolovanou poruchou komplexu I a dvou kontrolních liniích. První linie nesla mutaci m.3697G>A v MTND1 genu, druhá linie nesla mutace c.[229C>T];[476C>A] v NDUFS8 genu. Obě mutované podjednotky jsou součástí katalytického jádra komplexu I. Hladina heteroplasmie mutace m.3697G>A přesahovala ve fibroblastech 90 %. Ultrastruktura mitochondrií obou pacientů byla proti kontrole významně poškozena, mitochondriální síť vykazovala nehomogenní rozložení v buňce a u obou případů byl v...
|
|
|
Studium složení a organizace enzymového systému cytochromu P450 technikou kovalentního síťování
Koberová, Monika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Hansíková, Hana (oponent)
Systém oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systém) se významnou rolí podílí na metabolismu endogenních sloučenin i xenobiotik. Tento systém obsahuje cytochrom P450, NADPH:cytochrom P450 reduktasu a také jsou k němu přiřazovány NADH:cytochrom b5 reduktasa a cytochrom b5. Bylo prokázáno, že cytochrom b5 může stimulovat nebo inhibovat reakce katalyzované cytochromy P450, a dokonce může měnit poměr vzniklých metabolitů. Mechanismus působení cytochromu b5 nebyl dosud zcela objasněn. Zjištění protein-proteinových interakcí v MFO systému a určení topologie tohoto systému by mohlo pomoci k objasnění mechanismu působení cytochromu b5. Vhodnou metodou pro identifikaci protein-proteinových interakcí uvnitř membrány je technika kovalentního síťování. Cytochrom b5 obsahuje 3 methioniny, z čehož jsou 2 lokalizovány v C-terminální membránové kotvě. Po záměně těchto dvou methioninů za fotoaktivovatelný analog methioninu (foto-methionin) a následné fotoaktivaci lze určit interakce s cytochromem P450 v membránovém prostředí. Tato práce se zabývá expresí a izolací foto-cytochromu b5 (foto-cyt b5), analogu cytochromu b5 s inkorporovaným foto-methioninem. Podmínky pro inkorporaci foto- methioninu do cytochromu b5 byly optimalizovány a protein byl purifikován s výtěžkem 7,2 mg z 1 l bakteriální suspenze. Izolovaný foto-cyt...
|
host ::
RSS.