|
Biochemical and molecular studies of cytochrome c oxidase and ATP synthase deficiencies
Fornůsková, Daniela ; Zeman, Jiří (vedoucí práce) ; Hyánek, Josef (oponent) ; Stiborová, Marie (oponent)
Mgr. Daniela Fornůsková Disertační práce Studium poruch cytochrom c oxidasy a ATP synthasy na biochemické a molekulární úrovni ABSTRAKT Savčí organismus je plně závislý na systému oxidativní fosforylace (OXPHOS) jako hlavním zdroji produkce energie (ATP) v buňce. Poruchy OXPHOS mohou být způsobeny mutacemi v genech kódovaných mitochondriální DNA nebo jadernou DNA. Část výzkumné práce je zaměřena na roli raně a pozdně se asemblujících, jaderně kódovaných, strukturních podjednotek cytochrom c oxidasy (CcO) a Oxa1l, lidského homologu kvasinkové mitochondriální Oxa1 translokasy, v biogenezi cytochrom c oxidasy a její funkci s využitím stabilní RNA interference COX4, COX5A, COX6A1 a OXA1L a ektopické exprese epitopově značených podjednotek Cox6a, Cox7a a Cox7b v buněčné linii HEK (lidské embryonální ledviny)-293. Naše výsledky ukazují, že zatímco podjednotky Cox4 a Cox5a jsou nezbytné pro asemblaci funkčního komplexu CcO, Cox6a podjednotka je důležitá pro její stabilitu. V buňkách se sníženou expresí OXA1L byla překvapivě zjištěna normální aktivita i hladina holoenzymu CcO, přestože inaktivace OXA1 u kvasinek vyvolá kompletní ztrátu aktivity CcO. Při studiu poruch OXPHOS v izolovaných mitochondriích kosterního svalu, srdce, jater a frontálního kortexu získaných od pacientů s Leigh syndromem (mtDNA mutace...
|
|
Geometry and stability study of nucleic acids distinctive single-strand motifs
Říhová, Martina ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Mašek, Vlastimil (oponent)
Předmětem této práce je regulační úsek DNA, tzv. SRE (Serum Response Element), který vykazuje velmi specifické strukturní vlastnosti a jeho strukturní flexibilita pravděpodobně hraje klíčovou roli v jeho fyziologické aktivitě. Strukturní vlastnosti 16-merního SRE segmentu schopného tvořit vlásenky byly zkoumány pomocí přesných teplotně závislých měření Ramanových spekter. Jelikož strukturní stabilita oligonukleotidových řetězců úzce souvisí se stacking interakcí, byla provedena teplotně závislá měření Ramanových a UV absorpčních spekter na dinukleotidech, sloužících jako jednoduchý model pro studium této interakce. Měření byla zpracována pomocí SVD faktorové analýzy a z jejich výsledků vyplynulo, že stacking interakce závisí na pořadí bází. Pomocí fitu rovnic termodynamických rovnovah na SVD výsledky byly určeny termodynamické charakteristiky teplotně indukovaných strukturních změn komplexů tvořící smyčky a s jejich pomocí získána diferenční spektra charakterizující otevřené a uzavřené vlásenky, která umožnila bližší specifikaci geometrie těchto komplexů.
|
|
Studium transferinu jako markeru dědičných poruch glykosylace
Ondrušková, Nina ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Befekadu, Asfaw (oponent)
Dědičné poruchy glykosylace proteinů (CDG) představují rozsáhlou skupinu závažných metabolických onemocnění, která jsou způsobena poruchou v biosyntéze glykoproteinů. Pro "screeningové" vyšetření poruch N-glykosylace se využívá analýza sialovaných iso- forem sérového transferinu (Tf) pomocí isoelektrické fokusace (IEF). V případě nemoci dochází ke změnám v zastoupení jednotlivých isoforem Tf, rozlišujeme patologický pro- fil typu I (snížený tetra-, zvýšený di- a asialotransferin) a typu II (má navíc zvýšený tri- a monosialotransferin). Cílem diplomové práce bylo: 1) stanovit referenční rozmezí pro spektrum sialovaných forem Tf separovaných pomocí IEF a 2) provést u tří paci- entů (P1-P3) s klinickým podezřením na CDG biochemickou a molekulárně genetickou analýzu. Materiálem byly vzorky sér a genomové DNA od tří pacientů s klinickým po- dezřením na CDG a rodinných příslušníků od P1. Kontrolní soubor tvořilo 99 vzorků sér od zdravých jedinců ve věku 2-42 let. Sérum bylo analyzováno pomocí IEF s násled- nou imunofixací, SDS-PAGE a Western blotem s využitím specifické protilátky proti lidskému Tf (Dako). Profily Tf byly kvantifikovány pomocí programu AlphaEaseFC (Alpha Innotech). Data byla zpracována pomocí programu STATISTICA 9.0 (Stat- Soft). Analýza genů TF a PMM2 byla provedena pomocí cyklického...
|
|
Structural-Functional Correlations of Hydroxymethylbilane synthase
Douděrová, Dana
SOUHRN Akutní intermitentní porfyrie (AIP, OMIM 176000) je autosomálně dominantní vrozená porucha, která se řadí mezi akutní jaterní porfyrie. Je způsobená částečným snížením aktivity hydroxymetylbilan syntázy (HMBS, EC 4.3.1.8), třetího enzymu biosyntetické dráhy hemu. Klinické příznaky zahrnují gastrointestinální, neurologické a kardiovaskulární symptomy, ale nejčastějším projevem je abdominální bolest neuroviscerálního původu. Základním cílem této disertační práce bylo provádění molekulární analýzy DNA u pacientů s AIP. V případě, že je u pacienta nalezena mutace, testování DNA na molekulární úrovni je nabídnuto rovněž ostatním příbuzným. Tento individualizovaný přístup umožňuje zachycení asymptomatických jedinců v postižené rodině. Ti jsou pak informováni o vhodnosti požívání léků a o dalších faktorech, které mohou vyvolat nebezpečné akutní ataky. V ideálním případě je DNA diagnostika složena z robustní a efektivní skenovací metody a potvrzujícího kroku, který využívá DNA sekvenování. Rozhodli jsme se zavést skenovací metodu nové generace, která je vysoce citlivá a relativně časově i finančně nenáročná. Zvolili jsme metodu high-resolution melting (HRM) s využitím přístroje LightScanner. Dalším důležitým aspektem tohoto projektu bylo studium molekulární heterogenity AIP ve vztahu k struktuře proteinu....
|
|
Studium exprese a maturace mitochondriálního systému oxidativní fosforylace v průběhu prenatálního vývoje savců
Mrhálková, Andrea ; Hůlková, Martina (vedoucí práce) ; Ješina, Pavel (oponent)
Postnatální adaptace novorozence na extrauterinní prostředí je kromě jiného závislá na maturaci mitochondriálního systému oxidativní fosforylace (OXPHOS). Pro proces maturace je nezbytný efektivní průběh mitochondriální biogeneze během fetálního vývoje. Nedostatečnost systému OXPHOS se podílí na mortalitě a morbiditě předčasně narozených dětí. Hlubší porozumění průběhu mitochondriální biogeneze na molekulárně genetické a biochemické úrovni je tedy důležité pro zlepšení péče o předčasně narozené děti, zvláště o kriticky nemocné novorozence. Práce vznikla v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch na Klinice dětského a dorostového lékařství, 1. LF UK v Praze. Studie byla zaměřena na molekulárně genetické analýzy genů kódujících podjednotky ATP syntázy a charakterizaci změn v množství mitochondriální DNA v průběhu fetálního vývoje člověka a potkana. Výsledky přispívají k pochopení procesu mitochondriální biogeneze respektive biogeneze ATP syntázy ve fetálních tkáních člověka a potkana.
|
|
Studium deficitu lidské F1Fo-ATPsyntázy
Suldovská, Sabina ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Černá, Leona (oponent)
F1FO-ATPsyntáza je klíčovým enzymem buněčného energetického metabolismu. Její případný deficit může být způsoben mutacemi ve dvou strukturních genech MT-ATP6 a MT- ATP8 v mitochondriální DNA či v jaderných genech ATPAF2 a TMEM70 kódující faktory pro biogenezi enzymu a strukturním genu ATP5E. Deficit F1FO-ATPsyntázy vede k rozvoji velmi závažného fenotypu postihující orgány s vysokými energetickými nároky s nástupem v novorozeneckém věku a nepříznivou prognózou. Mutace v uvedených genech navíc nezpůsobují pouze kvalitativní (mutace ve strukturních podjednotkách enzymu) či kvantitativní (mutace v genech pro faktory biogeneze enzymu) defekty, ale také jejich kombinace. Při studiu molekulární podstaty mitochondriálních onemocnění včetně deficitu F1FO-ATPsyntázy se využívá široká škála biochemických i molekulárně-genetických metod pro stanovení správné diagnózy, která je nezbytná pro včasné zahájení symptomatické léčby a genetické poradenství v postižených rodinách. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat deficit F1FO-ATPsyntázy v izolovaných mitochondriích z linií kultivovaných buněk stanovením oligomycin-sensitivní ATP- hydrolytické aktivity F1FO-ATPsyntázy, enzymových aktivit komplexů dýchacího řetězce a sledováním změn v množství jednotlivých vybraných podjednotek a celého komplexu F1FO-...
|
|
EPR studium radikálových reakcí, iniciovaných rozpadem vybraných typů peroxidických sloučenin
Krkošková, Petra ; Kučerík, Jiří (oponent) ; Omelka, Ladislav (vedoucí práce)
Metodou EPR spektroskopie byly sledovány radikálové produkty rozpadu vybraných typů peroxidických sloučenin v přítomnosti redoxních činidel na bázi sloučenin olova a kobaltu. Kromě několika komerčně dostupných peroxidů byly studiu podrobeny také peroxidické sloučeniny ze skupiny tzv. luperoxidů (Luperox 101, Luperox 256, Luperox 531). Na detekci produktů rozpadu byla aplikována technika spin-trappingu, kde jako spin trap byl použit nitrosobenzen. Radikálové adukty, vznikající reakcí generovaných reaktivních kyslíkatých radikálů s nitrosobenzenem, měly charakter stabilních nitroxylových radikálů. Jejich EPR parametry byly získány metodou spektrální simulace. Kromě adice na nitrosobenzen byly generované kyslíkaté radikály prokázány také na základě jejich reakce s modelovými sloučeninami na bázi fenolů (Santonox R; 2,6–ditercbutyl–4–metylfenol) a sekundárního aminu (difenylamin).
|
|
Studium metabolismu vzdušných polutantů a mutagenů 3-nitrobenzanthronu a 2-nitrobenzanthronu
Čechová, Tereza ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Aromatické nitrosloučeniny jsou látky přítomné ve všech složkách životního prostředí. Jsou považovány za jeho toxické a karcinogenní kontaminanty. Většina nitroaromátů vykazuje v bakteriálních a savčích systémech mutagenní aktivitu. Existují karcinogeny vyvolávající nádorové procesy, především v játrech, plicích a prsních žlázách. 3-Nitrobenzanthron (3-NBA, 3-nitro-7H-benz[de]anthracen-7-on) je jednou z polycyklických aromatických nitrosloučenin s vysokými toxickými účinky. 3-NBA se vyskytuje ve složkách životního prostředí a je přítomný i ve výfukových plynech, byl také detekován v půdě a jeho výskyt byl prokázán i v dešťové vodě. 2 Nitrobenzanthron (2-NBA, 2-nitro-7H-benz[de]anthracen-7-on) je izomerem 3-NBA nalezeným jako polutant znečištěného ovzduší. I když je 2-NBA látkou slabě toxickou, jeho vysoká koncentrace v ovzduší by mohla představovat vysoké zdravotní riziko pro lidskou populaci. Diplomová práce rozšiřuje poznatky o metabolismu 3-NBA a jeho izomeru 2 NBA za anaerobních a aerobních podmínek. Ke studiu metabolismu těchto látek byly využívány jaterní mikrosomální systémy kontrolních potkanů (nepremedikovaných žádným induktorem cytochromů P450 - CYP) a potkanů premedikovaných Sudanem I, -naftoflavonem, fenobarbitalem, ethanolem a pregnenolon 16-karbonitrilem (PCN), látek, které indukují CYP 1A,...
|
|
Studium inkorporace modifikovaných aminokyselin do cytochromu b5
Koberová, Monika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Pavlásková, Kateřina (oponent)
Cytochrom b5 (cyt b5) může ovlivňovat reakce katalyzované cytochromy P450, a v důsledku toho se může podílet i na aktivaci látek (například léčiv, karcinogenů) případně ovlivňovat poměry vzniklých metabolitů. Mechanismu působení cyt b5 ještě nebyl zcela objasněn. Přínosem k objasnění mechanismu by mohlo být zjištění protein-proteinových interakcí v monooxygenasovém systému, kterého je tento protein součástí. Pro studium těchto interakcí pomocí síťovacích technik je vhodné připravit fotolabilní cyt b5, který by se po fotoaktivaci stal vysoce reaktivním a vytvořil by komplex s nejbližšími složkami v monooxygenasovém systému.Tato práce se zabývá vypracováním metody pro produkci rekombinantního cyt b5 s modifikovanými aminokyselinami. Cyt b5 byl exprimován v bakteriálním kmeni E.coli BL-21 (DE3) Gold. Před indukcí exprese byly bakterie převedeny do limitního media (DMEM-LM), které neobsahovalo L-leucin a L-methionin. Limitní mediu bylo doplněno modelovou deuterovanou aminokyselinou d3-methyl-L-methioninem a D,L-leucinem. Exprimovaný cyt b5 byl izolován a inkorporace d3-methyl-methioninu byla ověřena hmotnostní spektrometrií. V úvodních experimentech byl cyt b5 získán převážně jako apoprotein (apo-cyt b5). Pro zvýšení inkorporace hemu do apo-cyt b5 byl studován vliv teploty na inkorporaci hemu při...
|
|
Nebezpečné výrobky na českém trhu s systém mezinárodní výměny informací RAPEX
HONDLÍKOVÁ, Zuzana
Ve své bakalářské se věnuji problematice nebezpečných výrobků na českém trhu a systému mezinárodní výměny informací RAPEX. Problém importu nebezpečných výrobků do zemí EU, a tedy i do naší země má kvůli liberalizaci obchodu vzrůstající tendenci. Ve své závěrečné práci jsem proto chtěla zjistit, zda a jak je laická veřejnost informována o této problematice a jestli vůbec o toto téma jeví zájem. Cílem práce bylo proto zjistit a zanalyzovat nebezpečné nepotravinářské výrobky na českém trhu za rok 2011. Jelikož Česká republika je členem Evropské unie, je nutné na analýzu výstupů mezinárodního systému rychlé výměny RAPEX nahlížet v evropském měřítku. Dále jsem se zaměřila na monitoring zemí původu, které nejčastěji importují nebezpečné výrobky, a též o jaké výrobky se obvykle jedná. Jako teoretické vstupy pro výzkum jsem volila zdroje MZ, orgánů ochrany veřejného zdraví (KHS) a též informace Evropské komise (EK), která tuto problematiku v rámci EU monitoruje. Pro zjištění informovanosti veřejnosti jsem volila formu dotazníků, prostřednictvím nichž jsem zjišťovala informovanost specifické skupiny obyvatel, a sice matek dětí předškolního věku, jichž se bezprostředně dotýká problematika nebezpečných výrobků pro děti předškolního věku. Bakalářská práce je rozdělena na teoretickou a praktickou část. V teoretické části shrnuji pomocí dostupné literatury legislativní požadavky Evropské unie a České republiky na předměty běžného užívání, které zahrnují materiály a předměty určené pro styk s potravinami, hračky, kosmetické výrobky a výrobky pro děti ve věku do tří let. Laická veřejnost v této problematice hraje roli spotřebitele zboží, proto jsou v teoretické části zahrnuty i jejich práva a povinnosti. Stejně tak se této oblasti bezprostředně týkají i kompetence a činnost orgánů ochrany veřejného zdraví. V praktické části jsem zvolila kombinovaný přístup ke sběru a vyhodnocení dat. Nejprve byl proveden sběr dat a poté jejich studium metodou sekundární analýzy dat. Dále byl použit kvantitativní výzkum, kdy jsem získávala zpětnou reakci od laické veřejnosti a zjišťovala jejich znalosti, postoje a spotřebitelské chování. Jednotlivé cíle bakalářské práce byly splněny. Došla jsem k zjištění, že dotčená část populace nemá dostatečné informace o této problematice, respektive jí nevěnuje dostatečnou pozornost, a příliš nedůvěřuje orgánům ochrany veřejného zdraví. Její spotřebitelské chování se ale dá hodnotit pozitivně. Ze sekundární analýzy dat jsem zjistila, že se nejčastěji na evropský trh dostávají výrobky z Číny, a to hlavně oblečení a hračky. Jako nejčastější riziko u kosmetických výrobků se ukázal výskyt nebezpečného hydrochinonu. Nejčastější riziko u hraček a výrobků pro děti do tří let je udušení v důsledku technických nedostatků. Bakalářská práce by mohla být využita jako pomocný podklad při výuce hygieny předmětů běžného užívání a dále jako podklad pro případné mediální využití, jež by napomohlo lepší informovanosti laické veřejnosti, která zatím o této problematice nemá dostatečné podvědomí.
|
host ::
