|
|
Analýza senzoricky a toxikologicky významných látek v pivu
Vrzal, Tomáš
Jednou z nejvýznamnějších skupin toxikologicky významných látek v pivu jsou N-nitrosaminy. V této práci byla pozornost zaměřena zejména na netěkavé nitroso sloučeniny, jejichž koncentrace v pivu, chemická struktura a biologický účinek nejsou dosud známy. Z důvodu nedostatku znalostí o této skupině látek byla vyvinuta metoda pro jejich citlivou detekci prostřednictvím chemiluminiscenčního detektoru po plynově chromatografické separaci. Tato metoda zároveň umožňuje klasifikovat detekované nitroso sloučeniny do různých skupin (N-nitroso, C-nitroso a kombinace C-nitroso a nitro) a odlišit je od interferencí. Metoda využívá záznamu pyrolyzních profilů jednotlivých chromatografických píků, které jsou zpracovány pomocí diskriminační analýzy. Metoda byla vyvíjena za účelem nalezení a strukturní identifikace těchto dosud neznámých látek. Její aplikace na uměle nitrosovaný vzorek piva spolu s plynově chromatografickou analýzou s tandemovou hmotnostní detekcí vedl k strukturní identifikaci několika zástupců nitroso sloučenin. Senzoricky aktivní látky v této práci zastupují karbonylové sloučeniny a mastné kyseliny. Karbonylové sloučeniny - furfural a hydroxymethylfurfural - byly využity při vývoji mobilní, jednoduché, rychlé a objektivní metody pro in situ stanovení intenzity staré chuti piva, která je odrazem...
|
|
|
Proteomika jako nástroj studia molekulárních mechanizmů závažných onemocnění
Pospíšilová, Jana ; Petrák, Jiří (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Kovářová, Hana (oponent)
SOUHRN Proteomika je soubor analytických metod umožňující kvalitativní a kvantitativní popis proteomu. Expresní proteomika kvantitativně porovnává proteomy buněk, tkání, tělních tekutin a dalších biologických materiálů za různých podmínek s cílem nalézt rozdíly v expresi proteinů a na základě těchto rozdílů popsat biologické procesy probíhající ve zkoumaných organizmech. Výchozím materiálem expresních proteomických studií jsou složité směsi obsahující tisíce proteinů, které jsou analyzovány kombinací separačních (hlavně elektroforetických a chromatografických) metod a identifikovány, případně kvantifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Cílem této dizertační práce je demonstrovat využití nástrojů expresní proteomiky k řešení několika biomedicínských problémů. Různé proteomické přístupy a nástroje jsme využili ke studiu molekulárních mechanizmů závažných onemocnění jak na biologických vzorcích pacientů, tak na modelovém organizmu a buněčné kultuře. Konkrétně jsme řešili tři různé projekty, a to hledání potenciálních molekulárních cílů pro selektivní likvidaci buněk lymfomů z plášťové zóny rezistentních na protinádorovou molekulu TRAIL, studium molekulárních mechanizmů srdečního selhání s využitím potkaního modelu objemového přetížení a hledání diagnosticky využitelných biomarkerů karcinomu ovaria....
|
|
|
Proteomic analysis of soluble and transmembrane proteins in human lymphoma cells
Vít, Ondřej
V prezentovaných pracích jsme se s využitím proteomiky zabývali molekulárními změnami v buňkách lymfomu z buněk plášťové zóny (mantle cell lymphoma, MCL), souvisejícími s vznikem lékové rezistence. Identifikovali jsme tak kauzální a/nebo sekundární změny v proteinové expresi, spojené s rozvojem rezistence vůči experimentální molekule TRAIL a klinicky používaným antimetabolitům cytarabinu a fludarabinu. Odvozené buňky MCL rezistentní vůči proapoptotickému cytokinu TRAIL se vyznačovaly sníženou expresí klíčových enzymů metabolismu purinů. Tuto metabolickou dráhu tak lze považovat za "slabinu", kterou by bylo možné využít coby terapeutický cíl k selektivní eliminaci takovýchto rezistentních buněk. Rezistence vůči pyrimidinovému analogu cytarabinu se projevila křížovou rezistencí k dalším antinukleosidům. Proteomická a transkriptomická analýza ukázaly výrazně sníženou expresi deoxycytidin kinázy (dCK), jež je nutná k aktivaci purinových i pyrimidinových antinukleosidů. Tato změna vysvětluje křížovou rezistenci a je kauzálním mechanizmem rezistence vůči cytarabinu. Naše výsledky naznačují, že pacienti s MCL, u nichž selhala léčba založená na cytarabinu, by neměli být léčeni antinukleosidovými léčivy. Buňky MCL rezistentní vůči purinovému antinukleosidu fludarabinu vykazovaly křížovou rezistenci vůči...
|
|
|
Příprava rekombinantních forem extracelulární domény myších leukocytárních receptorů z rodiny NKR-P1.
Adámek, David
Myší receptory NK buněk patřící do rodiny NKR-P1 hrají roli v regulaci odpovědi těchto buněk z hlediska jejich aktivace, inhibice a produkce cytokinů. Tato diplomová práce se zabývá přípravou extracelulárních částí aktivačních receptorů mNKR-P1A a mNKR-P1C z myšího kmene C57BL/6. Cílem bylo připravit produkční vektor obsahující kódující sekvenci příslušných částí obou receptorů, optimalizovat jejich produkci v bakteriích E. coli a nalézt vhodný postup jejich renaturace a purifikace in vitro. Čisté proteinové preparáty byly následně ověřeny a analyzovány hmotnostní spektrometrií a rovněž značeny fluorescenční značkou za účelem hledání ligandu na buněčných preparátech. V budoucím výzkumu bude řešena struktura připravených proteinových preparátů a rovněž budou použity k hledání svých ligandů. Dané poznatky mohou v budoucnu dopomoci k lepšímu pochopení NK buněk.
|
|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
|
|
Proteomické přístupy ke studiu nádorových onemocnění
Lorková, Lucie ; Petrák, Jiří (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Kovářová, Hana (oponent)
Proteomika, jako soubor metod, technik a konceptů, byla využita ve třech projektech zaměřených na diagnózu a terapii onkologických onemocnění. První práce byla zaměřena na hledání spolehlivých a dostatečně senzitivních biomarkerů pro detekci karcinomu ovaria v jeho ranném stádiu. Dvěma odlišnými proteomickými přístupy jsme analyzovali séra žen s epiteliálním karcinomem ovaria a séra zdravých žen. Identifikovali jsme protein -1-antitrypsin s významně zvýšenou koncentrací v sérech pacientek a apolipoprotein A4 a retinol-binding protein 4 (RBP4) s významně sníženou koncentrací v sérech pacientek. Snížená koncentrace RBP4 v sérech žen s karcinomem ovaria může být výsledkem snížené produkce RBP4 ovariem nebo odrazem časných komplexních systematických změn v tělech pacientek. Cílem druhé práce bylo popsat molekulární mechanismus rezistence na cytarabin v buňkách lymfomu z buněk plášťové zóny (MCL). K proteomické analýze byly použity buněčné linie MCL a z těchto buněčných liniích byly získány subklony rezistentní na cytarabin. Mezi nalezenými změnami exprese proteinů byla detekována významná změna exprese deoxycytidin kinázy (DCK), jež je klíčovým enzymem v aktivaci purinových a pyrimidinových nukleosidů a jejich analogů. Buňky MCL rezistentní na cytarabin byly rovněž křížově rezistentní k jiným...
|
|
|
Proteom nádorové buňky a studium změn po působení protinádorových léčiv
Tylečková, Jiřina
Rakovina představuje velmi heterogenní skupinu onemocnění a výsledky v současnosti dostupné protinádorové léčby jsou vysoce variabilní s nedostatečnými počty vyléčených pacientů. Pro hledání a vývoj nových, selektivních a specifických, nádorových biomarkerů, které mohou být použity ke sledování stavu nemoci a terapie, se používá celá řada proteomických technik. S ohledem na výše zmíněné skutečnosti jsme se v této práci zaměřili na studium proteomu nádorových buněk a jeho změn po působení protinádorových léčiv se specifickým zaměřením na (a) odpověď ke konvenčním léčivům ze skupiny antracyklinů s přihlédnutím k jejich rozdílnému klinickému využití a (b) identifikaci nových terapeutických cílů v nádorových buňkách rezistentních k biologickým preparátům jako jsou inhibitory (b1) cyklin-dependentních kináz a (b2) Aurora kináz. V této studii jsme identifikovali několik klíčových aspektů, které se vztahovaly k účinkům daunorubicinu, doxorubicinu a mitoxantronu. Zaměřili jsme se na časné intervaly po působení léčiv, kdy je minimalizován vliv apoptózy, a nalezli jsme změny proteinů metabolických a celulárních procesů společné pro všechna tři léčiva. Podstatnější bylo pozorování signifikantních změn proteinů účastnících se tvorby metabolických a energetických prekurzorů, které byly specifické pro působení...
|
|
|
Rychlé metody analýzy migrantů z materiálů ve styku s potravinami
Vavrouš, Adam ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Jelínek, Ivan (oponent) ; Bajerová, Petra (oponent)
Materiály ve styku s potravinami představují zdravotní riziko díky široké paletě škodlivin, které se z nich mohou uvolňovat do potravin. Mezi tyto látky, migranty, patří aromatické uhlovodíky, dialkyl-ftaláty, bisfenoly, fotoiniciátory tiskařských barev a perfluoralkylové sloučeniny. Stanovení všech těchto látek může být nákladné a časově náročné, protože v současné době chybí univerzálně použitelné analytické přístupy. Tato práce se pokusila vyvinout metody pro současné stanovení migrantů ze všech zmíněných skupin v materiálech ve styku s potravinami na bázi papíru a v tučných potravinách. V papírových výrobcích bylo studováno celkem 68 potenciálních škodlivin pomocí kapalinové chromatografie a plynové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí. Všechny analyty se podařilo izolovat současně použitím modifikované metody "QuEChERS". Ve validační studii tato metoda prokázala přijatelnou výtěžnost a opakovatelnost pro většinu analytů; LOQ se pohybovaly v rozmezí 1,3-220 µg/kg. Analýza 132 reálných papírových výrobků potvrdila výskyt téměř všech studovaných analytů, které byly mnohdy přítomny v komplexních směsích a v koncentracích až 628 mg/kg. Celkem 41 potenciálních škodlivin bylo sledováno v tučných potravinách pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí. Hlavní úskalí...
|
|
|
Analýza složení a degradace léčivých látek a léčivých přípravků z 18. a 20. století
Kudláček, Karel ; Nesměrák, Karel (vedoucí práce) ; Bosáková, Zuzana (oponent) ; Gabriel, Jiří (oponent)
Dizertační práce se zaměřila na analýzu dvaceti historických pozůstatků léčivých látek a léčivých přípravků datovaných do 18. a 20. století metodami kapalinové a plynové chromatografie s UV spektrometrickou a hmotnostní detekcí. Analytický přístup byl zvolen s ohledem na stáří a lékovou formu analyzovaného léčivého přípravku. Autenticita historických léčivých látek a léčivých přípravků byla ověřena identifikací účinných látek, jejich možných degradačních produktů a dalších pomocných látek tandemovou hmotnostní spektrometrií a případně porovnáním s novodobými referenčními materiály. Tandemovou hmotnostní spektrometrií byla rovněž studována fragmentace vybraných analytů. Stabilita historických pozůstatků léčiv z 20. století byla hodnocena na základě poklesu koncentrace účinných látek v porovnání s obsahem deklarovaným výrobci nebo v případě historických pozůstatků léčiv z 18. století na základě porovnání koncentrací účinných látek stanovených v historickém pozůstatku a v současném referenčním materiálu. K analýze historických pozůstatků mastí byl použit multianalytický přístup kombinující pět analytických metod, jejichž výsledky se vzájemně doplňují. Zatímco účinné látky identifikované v droze ipekakuanhy byly nalezeny částečně degradované, v extraktu senny byly degradovány zcela. V případě léčivých...
|
|
|
Chromatographic and mass-spectrometric analysis of lipids of vernix caseosa
Vavrušová, Aneta
Lipidomika je rychle se rozšiřující vědní obor, který zaznamenal v posledních letech vzrůstající pozornost a to zejména díky zvyšujícímu se vědomí o stěžejních rolích lipidů v biologických systémech. Hlavním cílem lipidomiky je systematické studium všech lipidů, zahrnuje popis jejich struktury, biologických funkcí v buňce a rovněž popis interakcí lipidů s dalšími molekulami. Spojení pokročilých analytických metod, jako je extrakce, chromatografie a hmotnostní spektrometrie, umožňuje efektivním způsobem studovat všechny aspekty lipidomiky. Předkládaná dizertační práce je komentovaným souborem ke dvěma publikovaným pracím a zabývá se využitím separačních technik a hmotnostní spektrometrie pro detekci a strukturní charakterizaci nových lipidových tříd v novorozeneckém mázku. V prvním případě bude popsáno použití techniky bezvodé kapalinové chromatografie na reverzní fázi ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií s chemickou ionizací za atmosférického tlaku (LC-APCI-MS2 ) pro strukturní charakterizaci cholesterol esterů ω-(O-acyl)-hydroxy mastných kyselin (Chl-ωOAHFAs) v novorozeneckém mázku. Pro účel izolace neutrálních Chl-ωOAHFAs byla vyvinuta metoda adsorpční tenkovrstvé chromatografie. Obecná struktura Chl-ωOAHFAs byla odvozena na základě analýzy jejich produktů transesterifikace a...
|
host ::
RSS.