|
|
Ribosomal protein Rpl22 regulates the splicing of its own transcripts
Nemčko, Filip ; Abrhámová, Kateřina (vedoucí práce) ; Müller-McNicoll, Michaela (oponent)
Kvasinka Saccharomyces cerevisiae patrí medzi organizmy s malým počtom intrónov, ktoré sa nachádzajú v približne 5% jej génov. Najdôležitejšou skupinou takýchto génov sú gény kódujúce ribozomálne proteíny. Tie sú okrem iného vysoko exprimované a častokrát kódované dvoma paralógmi. Parenteau s kolegami popísala intrón-dependentné intergénové regulačné obvody, ku ktorým dochádza medzi ribozomálnymi paralógmi a ktoré kontrolujú pomery ich expresie. V tejto práci sa nám nepodarilo potvrdiť prítomnosť takýchto obvodov u 6 zo 7 testovaných párov paralógov. Jedinou funkčnou je regulácia u RPL22 paralógov. Ukázali sme, že Rp22 proteín blokuje pre-mRNA zostrih oboch RPL22 paralógov, avšak prednostne RPL22B. Proteín Rpl22 to sprostredkováva väzbou na sekundárnu štruktúru v RPL22B intróne, pričom mutácia RNA-väzbovej domény proteínu Rpl22 vedie k strate väzby. Takáto sekundárna štruktúra a väzba na ňu je zachovaná aj v kvasinke Kluyveromyces lactis, ktorá obsahuje iba jednu kópiu RPL22 génu. Výsledky tejto práce vedú k lepšiemu porozumeniu intergénovej regulácie, ku ktorej dochádza medzi funkčne odlišnými RPL22 paralógmi. Kľúčové slová intróny, gény ribozomálnych proteínov, Rpl22, RPL22 paralógy, zostrih pre-mRNA, Saccharomyces cerevisiae
|
|
|
Vliv transkripčních regulačních elementů na sestřih pre-mRNA
Volek, Martin ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Malík, Radek (oponent)
Při sestřihu pre-mRNA jsou z pre-mRNA odstraněny introny a dochází ke spojení exonů. Současné studie dokazují, že až 95 % genů, které mají více než dva exony, se mohou účastnit alternativního sestřihu pre-mRNA, tedy procesu, při kterém může či nemusí dojít k zahrnutí exonu do výsledné mRNA. Většina sestřihu pre-mRNA se uskutečňuje kotranskripčně, tedy v době, kdy je RNA polymerása II stále spojena s pre-mRNA. Alternativní sestřih je velmi komplikovaný a komplexní proces, který probíhá v blízkosti DNA a histonů, jež mohou tento proces ovlivňovat. Předchozí studie validovaly gen fibronektinu (FN1) a jeho alternativní exony EDA a EDB (extra doména A a B) jako vhodné modely pro studium alternativního sestřihu. Studie používající minireportérový systém FN1 skládající se z exonu EDA, dvou sousedních intronů a exonů dokázaly, že při vnesení transkripčního enhanceru SV40 před promotor tohoto systému, dochází ke snížení zahrnutí exonu EDA ve výsledné mRNA. Není však známe, zda obdobný mechanizmus funguje i mimo reportérový systém v genomu a zda vzdálené transkripční regulační elementy mohou mít vliv na alternativní sestřih. Proto byl pomocí programů The Ensemble Regulatory Build a FANTOM 5 identifikován potenciální transkripční enhancer, který se nachází 23,5 kbp před místem začátku transkripce (TSS) pro...
|
|
|
The role of pre-mRNA splicing in human hereditary diseases
Malinová, Anna ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Malá jaderná ribonukleoproteinová částice U5 (U5 snRNP) je jednou z hlavních komponent spliceozomu, komplexu který katalyzuje sestřih pre-mRNA. U5 snRNP je tvořena molekulou RNA a několika proteiny, nicméně o tom jak jsou jednotlivé díly postupně skládány v maturovanou částici, se mnoho neví. Ukázali jsme, že po depleci proteinu PRPF8, jedné z klíčových složek U5 snRNP, se částice správně neskládají a akumulují se v jaderných strukturách zvaných Cajalova tělíska. K objasnění role PRPF8 v biogenezi U5 snRNP jsme se dále rozhodli využít mutace tohoto proteinu, které byly identifikovány u pacientů s degenerativním onemocněním oční sítnice, retinitis pigmentosa (RP). Vytvořili jsme stabilní buněčné linie exprimující mutantní varianty proteinu PRPF8 a ukázali jsme, že RP mutace narušují skládání U5 snRNP, což následně vede ke snížení efektivity sestřihu pre-mRNA v buňkách. Mutantní PRPF8 se spolu s proteinem EFTUD2 hromadí v cytoplazmě a vytvoření tohoto komplexu je zdá se prvním krokem skládání U5 snRNP. Dále jsme s využitím proteomických metod identifikovali řadu nových faktorů včetně komlexu HSP90/R2TP a proteinu ZNHIT2, které se váží na U5 snRNP. Naše výsledky ukazují, že tyto faktory preferenčně interagují...
|
|
|
Formation of splicing machinery in the context of the cell nucleus
Stejskalová, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Většina genů kódujících proteiny vyšších eukaryot obsahuje introny, které musí být odstraněny z primárních transkriptů. Vznikající mRNA může být poté použita jako templát pro syntézu proteinů. Sestřih intronů probíhá za pomoci složitého sestřihového komplexu, který se skládá z malých jaderných ribonukleoproteinových částic. Tyto částice vznikají během několika postupných kroků, které se odehrávají jak v jádře, tak v cytoplazmě. Sestřihový komplex se poté postupně skládá na molekule pre- mRNA. Jedná se o velmi dynamický a přesně regulovaný proces, který závisí nejen na sekvenci samotné pre-mRNA, ale záleží i na stavu celého jádra, např. na modifikacích chromatinu. Mezi základní nezodpovězené biologické otázky patří například: Jak buňky řídí, kdy a kde se sestřihový komplex poskládá? Co předurčuje, které introny budou vystřiženy? V této práci zkoumáme sestřihový komplex a jeho skládání v kontextu buněčného jádra z několika různých úhlů pohledu. Za prvé se věnujeme neočekávané souvislosti mezi sestřihovým faktorem U1-70K a komplexem SMN (z angl. survival of motor neurons), který je hlavním účastníkem biosyntetické dráhy malých jaderných ribonukleoproteinových částic. Podařilo se nám odhalit, že protein U1-70K interaguje s komplexem SMN a že tato interakce je klíčová pro stabilitu gems, malých nemembránových...
|
|
|
Mapping of SART3 interactions with spliceosomal snRNPs
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hnilicová, Jarmila (oponent)
Sestřih pre-mRNA je katalyzován obrovským a velmi dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (označovaných jako snRNP) a více než stovky dalších proteinů. Biogeneze sestřihových snRNP částic je komplikovaný proces, jehož závěrečné kroky se odehrávají ve specializovaných jaderných útvarech, Cajalových tělíscích. Molekulární podstata cílení snRNP částic do Cajalových tělísek však zůstává nejasná. Naše předchozí výsledky odhalily, že protein SART3 je důležitý pro akumulaci U4, U5 a U6 snRNP v Cajalových tělíscích, není ale známo, jakým způsobem SART3 tyto sestřihové částice váže. SART3 byl původně identifikován jako interakční partner U6 snRNP a faktor napomáhající složení U4/U6 di-snRNP částice. V této práci nicméně ukazujeme, že SART3 interaguje také s U2 snRNP a že specificky váže nesložené U2 částice. Dále poskytujeme důkazy, že SART3 asociuje s U2 snRNP přes Sm proteiny, které tvoří stabilní jádro čtyř z pěti hlavních snRNP částic (tzn. U1, U2, U4 a U5). Na základě našich výsledků navrhujeme, že interakce mezi SART3 a Sm proteiny představuje obecný mechanismus, jak SART3 rozpoznává nekompletní snRNP částice a kontroluje tak jejich skládání v Cajalových tělíscích.
|
|
|
Recyklace sestřihových komplexů
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Hálová, Martina (oponent)
Ve většině lidských genů jsou kódující úseky (exony) přerušovány dlouhými nekódujícími sekvencemi (introny). Po přepisu genu do pre-mRNA musí být tyto introny velmi přesně vyštěpeny v procesu zvaném sestřih. Sestřih je zajišťován velmi složitým a dynamickým sestřihovým komplexem, který se skládá z pěti malých jaderných ribonukleoproteinových částic (snRNP) a řady sestřihových proteinů. Každá částice obsahuje jednu malou jadernou RNA a několik specifických proteinů a vzniká postupným procesem, který se odehrává v jádře i cytoplazmě. Závěrečné úpravy pak probíhají v jaderných Cajalových tělíscích. Hotové částice nasedají v přesně daném pořadí na pre-mRNA a formují komplex, který katalyzuje dvě transesterifikační reakce potřebné k vystřižení intronu a spojení okolních exonů a následně se opět rozpadá na jednotlivé snRNP. Ribonukleoproteinové částice během sestřihu podstupují nejrůznější změny jak v konformaci, tak v proteinovém složení. Proto musí před každým dalším kolem sestřihu projít recyklačními úpravami a vrátit se do stavu vhodného pro připojení k novému sestřihovému komplexu. Recyklační fázi sestřihového cyklu nicméně zatím obklopuje více otázek než odpovědí. Cílem této práce je pokusit se ve světle nových poznatků alespoň na některé z nich odpovědět.
|
|
|
Mer1 a Nam8 v regulaci sestřihu.
Marková, Michaela ; Abrhámová, Kateřina (vedoucí práce) ; Stejskalová, Eva (oponent)
Proteiny Mer1 a Nam8 vzájemnou kooperací aktivují sestřih čtyř specifických pre-mRNA genů: AMA1, MER2, MER3 a SPO22 potřebných pro meiotickou rekombinaci a jaderné dělení. Exprese těchto genů se v rámci buněčného cyklu nemění, ale k efektivnímu sestřihu jejich pre-mRNA dochází pouze v průběhu meiózy, protože pouze v meiotických buňkách je exprimován protein Mer1, který usnadňuje jejich sestřih. Všechny tyto pre-mRNA obsahují nekonsensuální 5'sestřihové místo (5'splice site, 5'ss), které je ve srovnání s konsensuální sekvencí hůře rozpoznatelné pro podjednotkou spliceosomu U1 snRNP. Na pre-mRNA těchto genů se nachází enhancerová oblast v blízkosti 5'ss, na kterou se váže Mer1p, jenž zefektivňuje vyvazování U1 snRNP. Mer1p spolupracuje prostřednictvím dalších proteinů s Nam8p, který je součástí U1 snRNP. Nam8p se váže na pre-mRNA downstream od 5'ss v blízkosti enhancerové oblasti. Mer1p a Nam8p společně usnadňují sestavování spliceosomu na nekonsensuálním 5'ss a následně sestřih pre-mRNA.
|
|
|
Functional analysis of hPrp8 mutations linked to retinitis pigmentosa.
Matějů, Daniel ; Cvačková, Zuzana (vedoucí práce) ; Král, Vlastimil (oponent)
hPrp8 je esenciální faktor účastnící se sestřihu pre-mRNA. Tento vysoce konzervovaný protein je součástí U5 malé jaderné ribonukleoproteinové částice (U5 snRNP), která představuje jednu ze základních komponent spliceozomu. hPrp8 působí jako klíčový regulátor aktivace spliceozomu a interaguje přímo s U5 snRNA a s oblastmi pre-mRNA, které se účastní transesterifikačních reakcí během sestřihu. Mutace v hPrp8 způsobují autozomálně dominantní formu retinitis pigmentosa (RP), dědičného onemocnění, které vede k postupné degeneraci sítnice. V této práci jsme zkoumali, jak mutace spojené s RP ovlivňují funkci proteinu hPrp8. Použili jsme metodu 'BAC recombineering' k vytvoření mutovaných variant hPrp8-GFP a připravili jsme stabilní buněčné linie exprimující tyto rekombinantní proteiny. Mutované proteiny byly exprimovány a lokalizovány do jádra, avšak jedna z bodových mutací výrazně ovlivnila lokalizaci a stabilitu hPrp8. Další experimenty napověděly, že mutace spojené s RP ovlivňují schopnost hPrp8 interagovat s dalšími komponenty U5 snRNP a s pre-mRNA. Dále jsme studovali biogenezi U5 snRNP komplexů. Pomocí siRNA jsme odstranili hPrp8 a narušili tak formování U5 snRNP komplexu. Zjistili jsme, že nekompletní U5 snRNP komplexy se hromadí v Cajalových tělískách, což značí, že tyto jaderné struktury hrají roli...
|
|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
|
|
Funkce proteinu Slu7 v sestřihu pre-mRNA Saccharomyces cerevisiae
Ničová, Eva ; Půta, František (vedoucí práce) ; Vašicová, Pavla (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z nástrojů regulace genové exprese. Za různých podmínek mohou z jednoho buněčného transkriptu vznikat různé mRNA kódující proteiny s různou funkcí, lokalizací či stabilitou. Lidský protein hSlu7 ovlivňuje alternativní sestřih některých genů prostřednictvím volby alternativních 3'sestřihových míst (3'SS). Ačkoli se původně zdálo, že kvasinky Saccharomyces cerevisiae alternativní sestřih nevyužívají, v poslední době se množí důkazy, že tomu tak není. Rozhodli jsme se proto blíže charakterizovat funkci kvasinkového Slu7, který se účastní druhého kroku sestřihu pre-mRNA a je úzce spjatý s volbou 3'SS. Pozornost jsme zaměřili na vysoce sekvenčně konzervovaný, doposud nepopsaný motiv v esenciální části proteinu, nazvaný motiv RED. Mutace v motivu způsobují defekt druhého kroku sestřihu některých substrátů a ovlivňují poměr využití alternativních 3'SS některých sestřihových konstruktů. Výsledky pokusů ukazují na roli motivu ve výběru především distálních 3'SS. Genetické interakce mutací slu7 s alelami genů PRP45 a PRP22 rozšiřují spletitou interakční síť sestřihových faktorů a naznačují možnou roli Slu7p ve vazbě Prp22p na spliceosom.
|
host ::
RSS.