|
|
Mechanizmus rezistence cytoplazmatické membrány Bacillus subtilis k surfaktinu
Seydlová, Gabriela ; Svobodová, Jaroslava (vedoucí práce) ; Spížek, Jaroslav (oponent) ; Julák, Alois (oponent)
Surfaktin produkovaný bakterii Bacillus subtilis je povrchově aktivní látka a antibiotikum, jehož zásahovým místem je cytoplazmatická membrána. Jedním z faktorů omezujících využití jeho širokého biologického potenciálu v praxi je neznalost mechanizmu rezistence producenta. Cílem práce bylo proto objasnit způsob, jakým produkční kmen Bacillus subtilis čelí poškození cytoplazmatické membrány surfaktinem. Za tímto účelem byly připraveny dva izogenní páry kmenů B. subtilis lišící se pouze schopností, resp. neschopností syntetizovat surfaktin. Bylo zjištěno, že s nástupem biosyntézy surfaktinu nastupuje časná odpověď producenta spočívající ve zvyšování obsahu lipidů a tím snižování poměru surfaktin-lipid v membráně. Paralelně s rostoucí koncentrací surfaktinu narůstá podíl aniontových fosfolipidů reprezentovaný především kardiolipinem, který tvoří až 24 % membránových fosfolipidů. Současně s poklesem zastoupení fosfatidyletanolaminu je membrána producenta stabilizována, a tak chráněna před interakcí se surfaktinem. Účinnost adaptivní odpovědi potvrzuje vyšší rigidita nitra i povrchu membrány producenta měřená ustálenou anizotropií sond DPH a TMA-DPH. Ve 24. hodině kultivace byla zaznamenána indukce serinové protein kinázy PrkA, jejíž úloha pro producenta surfaktinu je diskutována a bude předmětem dalšího studia....
|
|
|
Studium biosyntetické dráhy antibiotika linkomycinu
Novotná, Jitka ; Spížek, Jaroslav (vedoucí práce) ; Weiser, Jaroslav (oponent) ; Gašparík, Juraj (oponent)
1. L.3'4-Dihydroxyphenyl a|anine.extraďo|cleavage cyclizationin lincomycin biosynthesis. is followed by intra-molecular The aim of the work gene,characterizeit better DOPA aromaticring is the lincomycinsynthesis. was to assignfunctionto the proteincodedfor by an lmbBl and confirm the assumptionthat2,3-extradiolfission of the actualreactioninvolvedin the metabolicpathwayleadingto fooH HrN-) aOH tyÍo8|n cooH cooH ,,"1 ,,"4 .Ť:+*.i'} 2'3.6ÓcoDoPA /t{3€Íboxy+ox}prcponý}2'34|hyÚ} 1/í pyÍrolc2€íboxy|lo rc|d Fig' 1 |nitia|steps of the amino acid subpathway oÍthe |incomycin biosynthesis The resultsof the feedingexperimentswith labeledintermediatesand subsequent NMR analysis(BRAHME etal., 1984),bearedwitnessof thefactthattheaminoacid sub- pathwayof thelíncomycinbiosynthesisincludes2,3-extradiolcleavageof DoPA (Fig. 1). Neusser and coworkers (NEUSSER et al., 1998) showed that LmbBl catalyzes conversionof DOPA to anunspecifiedyellowcompound. It appearedinapplicableto isolatethe LmbBl reactionproductdirectlyfrom in y,itroreacÍioncatalyzedby thepurifiedLmbBl partlyas LmbBl lost mostof its activity duringdialysis.mostprobablydue to oxidationof theferrousion proposedas a cofactor, andpartlydue to thefact thatmanydiÍ.ferentDoPA oxidationproductswereproducedin the system.Instead,a system simrlar to that applied Íbr...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Geny kodující acetyhydroxy syntázu u Streptomyces cinnamonensis a jejich regulační oblast:Mutace v katalytické podjednotce zjią»ující necitlivost k inhibici konečného produktu
Kyselková, Martina ; Kopecký, Jan ; Šigutová, Lucie ; Pospíšil, Stanislav ; Felsberg, Jürgen ; Spížek, Jaroslav ; Janata, Jiří
Geny ilvB kódující katalytickou podjednotku AHAS u rodičovského kmene S. cinnamonensis a čtyř mutantů s deregulovanou biosyntetickou drahou valinu byly sekvenovány. Mutace byly nalezeny u dvou kmenů, jejichž AHAS byla v hrubém buněčném extraktu zdánlivě aktivována valinem. U kmene BVR-18 byla nalezena mutace C574A vedoucí v proteinu k substituci E139A. U kmene ACB-NLR-2 došlo k deleci tripletu AGC v pozici 805-807, což v proteinu vedlo k deleci Q217. Podle homologního modelu katalytické podjednotky, vytvořeného na základě krystalové struktury dimeru katalytických podjednotek AHAS u Saccharomyces cerevisiae, se substituce E139A vyskytla ve smyčce na rozhraní podjednotek poblíž TPP vazebného místa, zatímco ?Q217 v helixu odlehlém od aktivního místa. Jednotlivé podjednotky byly exprimovány v E. coli za účelem rekonstituce enzymů in vitro, jejichž aktivita v přítomnosti a nepřítomnosti 10 mM valinu byla měřena. Podařilo se prokázat, že substituce E139A je zodpovědná za zdánlivou aktivaci AHAS valinem pozorovanou u kmene BVR-18. U kmenů ACBR-2 a NLR-3 se zvýšenou hladinou aktivity AHAS nebyla zjištěna žádná mutace v katalytické podjednotce. Regulační oblast před genem ilvB těchto dvou kmenů a kmene rodičovského byla sekvenována. V rámci této oblasti byly nalezeny některé prvky atenuátoru, ale sekvence se u kmenů ACBR-2 a NLR-3 shodovala se sekvencí rodičovského kmene. Zdá se tedy, že regulace exprese AHAS je zajištěna ještě jiným mechanismem, než je atenuace.
|
|
|
Analýza genového clusteru anthramycinových a lincosamidových antibiotik
Jelínková, Markéta ; Koběrská, Markéta ; Čermák, Lukáš ; Kopecký, Jan ; Janata, Jiří ; Spížek, Jaroslav
Ve shluku genů kódujících biosyntézu linkomycinu bylo zjištěno 27 otevřených čtecích rámců s biosyntetickou či regulační funkcí a 3 rezistenční geny. Ze srovnání chemické struktury linkomycinu a celesticetinu vyplývá, že v biosyntetické dráze chybí dráha vedoucí k propylprolinu a prolin je přímo substrátem kondenzační reakce. Část biosyntetické dráhy zahrnující přeměnu L-tyrosinu na propyl-L-prolin by měla být přítomna v biosyntetické dráze funkčně odlišných antramycinových antibiotik. Byla zjišťováno rozvržení genu linkomycinového biosyntetického shluku do transkripčních jednotek. Dále byla na základě sekvence tohoto shluku navržena sada sond, pomocí nichž byly vyhlédávány analogy genů v producentech celesticetinu Streptomyces caelestis a antramycinů Streptomyces refuineus, Streptomyces albus and Streptosporangium sibiricum.
|
|
| |
|
|
Antibiotika-mechanismus účinku, rezistence a hledání nových látek
Spížek, Jaroslav
Podle mechanizmu účinku se antibiotika dělí do 4 skupin: 1. Antibiotika inhibující biosyntézu bakteriální buněčné stěny, 2. Antibiotika inhibující syntézu DNA. 3. Antibiotika inhibující syntézu RNA. 4. Antibiotika inhibující protesyntézu. Základní mechanizmy rezistence vůči antibiotikům jsou: 1. Neprůchodnost buněčných obalů. 2. Modifikace zásahového místa. 3. Modifikace nebo degradace antibiotika. 4. Zvýšený eflux antibiotika. Jako zdroj nových antibiotik mohou sloužit: 1. Mikroorganizmy izolované v extrémních podmínkách prostředí. 2. DNA izolované z prostředí (eDNA), v které jsou hledány geny kódující sekundární metabolity. 3. Genomika streptomycetů poskytující informace o genech kódujících biosyntézu nových látek. 4. Znalosti o biosyntéze sekundárních metabolitů využívané při přípravě hybridních antibiotik.
|
host ::
RSS.