|
|
Exprese rekombinantní rozpustné formy receptoru NKR-P1A
Vaňková, Pavla ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Mrázek, Hynek (oponent)
NK buňky jsou velké granulární lymfocyty a jsou součástí přirozeného imunitního systému. Při boji proti nádorovým či virem infikovaným buňkám spouští své cytotoxické mechanismy a produkcí cytokinů dokáží zmobilizovat i pomoc ve formě adaptivní imunitní odpovědi. V poslední době jsou velkou oblastí zájmu, neboť nalezení ligandů k jejich receptorům a pochopení interakce s nimi může vést k významným objevům. Hlavně v oblasti medicíny, kde mohou mimo jiné najít uplatnění při transplantacích, v boji proti nádorovému bujení nebo HIV. Tato bakalářská práce se zabývá receptorem NKR-P1A, který je spolu s dalšími šesti receptory členem NKR-P1 rodiny. Tento protein se řadí mezi aktivační receptory a nedávno byla objevena jeho isoforma, která se od klasické formy liší tím, že postrádá větší část transmembránové domény. Cílem této práce bylo připravit produkční plasmid nesoucí gen pro mNKR-P1A ISO2 s následným testem exprese daného proteinu.
|
|
| |
|
|
α-N-Acetylgalactosaminidase as a tools in the synthesis of complex oligosaccharide immune stimulators
Mrázek, Hynek
Použití α-N-acetylgalaktosaminidasy jako nástroje vhodného pro syntézu komplexních oligosacharidových stimulátorů imunitního systému Úvod: Alfa-N-acetylgalaktosaminidasy jsou exoglykosidasy specificky štěpící terminálně vázaný α-N-acetylgalaktosamin v různých sacharidových řetězcích neboz aminokyselin serin nebo threonin. Tyto enzymy jsou široce rozšířené, vyskytují se téměř v každém organismu. Stabilita a aktivita v extremních podmínkách je důležitá vlastnost, které se hojně využívá při mnoha průmyslových aplikací. Studium velkého množství extracelulárních α-N-acetylgalaktosaminidas izolováných z vlaknitých hub byl nalezen nejlepší producent Asperillus niger CCIM K2. Enzym izolovaný z vlaknité houby Aspergillus niger vykazoval jedinečné vlastnosti, které byly dále zkoumány. Metody: Alfa-N-acetylgalaktosaminidasa izolována z A.niger byla částečně sekvenována pomocí Edmanova odbourávání a MALDI MS. Na základě zjištěných sekvencí byly navrženy degenerované oligonukleotidy. Gen kódujíci α-N-acetylgalaktosaminidasu byl amplifikovan pomocí PCR. Jako templát byla použita cDNA izolovaná z A.niger. Získaný gen byl ligován do expresního vektoru pYES-2CT a rekombinantní protein byl exprimován v kvasinkovém expresním systému Saccharomyces cerevisiae. Byly optimalizovány podmínky exprese tohoto proteinu. Protein byl...
|
|
| |
|
|
Studium struktury receptoru DCL-1 pomocí hmotnostní spektrometrie
Růžičková, Barbora ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Mrázek, Hynek (oponent)
DCL-1 (CD302) je transmembránový C-lektinový receptor typu I, který je exprimován na monocytech, makrofázích, granulocytech a dendritických buňkách. Jeho extracelulární doména však postrádá aminokyselinové motivy, esenciální pro vazbu sacharidových struktur v přítomnosti vápenatých kationtů, což naznačuje, že nemá klasickou vazebnou aktivitu typickou pro C-lektinové receptory jako například manosový receptor. Žádné jeho exogenní nebo endogenní ligandy ovšem nebyly dosud nalezeny. V důsledku vnitřní kolokalizace s F-aktinem lze předpokládat, že tento nekonvenční lektinový receptor hraje důležitou roli nejen v endocytóze a fagocytóze, ale také v buněčné adhezi a migraci. Receptor DCL-1 byl poprvé identifikován jako genetický fúzní partner lidského multilektinového receptoru DEC-205 v buněčné linii Hodgkinova lymfomu. Experimentální část této práce se zabývá identifikací zapojení disulfidických vazeb a získání dat k validaci krystalové struktury DCL-1. Nejprve byla provedena optimalizace podmínek produkce a renaturace za účelem získat co největší množství proteinu DCL-1, resp. jeho extracelulární domény. Optimální podmínky byly využity k přípravě proteinu, se kterým bylo provedeno štěpení v gelu specifickými endopeptidasami za přítomnosti cystaminu následované LC-MS analýzou. Porovnáním naměřených dat z LC-MS...
|
|
|
Exprese rekombinantní rozpustné formy receptoru NKR-P1A
Vaňková, Pavla ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Mrázek, Hynek (oponent)
NK buňky jsou velké granulární lymfocyty a jsou součástí přirozeného imunitního systému. Při boji proti nádorovým či virem infikovaným buňkám spouští své cytotoxické mechanismy a produkcí cytokinů dokáží zmobilizovat i pomoc ve formě adaptivní imunitní odpovědi. V poslední době jsou velkou oblastí zájmu, neboť nalezení ligandů k jejich receptorům a pochopení interakce s nimi může vést k významným objevům. Hlavně v oblasti medicíny, kde mohou mimo jiné najít uplatnění při transplantacích, v boji proti nádorovému bujení nebo HIV. Tato bakalářská práce se zabývá receptorem NKR-P1A, který je spolu s dalšími šesti receptory členem NKR-P1 rodiny. Tento protein se řadí mezi aktivační receptory a nedávno byla objevena jeho isoforma, která se od klasické formy liší tím, že postrádá větší část transmembránové domény. Cílem této práce bylo připravit produkční plasmid nesoucí gen pro mNKR-P1A ISO2 s následným testem exprese daného proteinu.
|
|
|
α-N-Acetylgalactosaminidase as a tools in the synthesis of complex oligosaccharide immune stimulators
Mrázek, Hynek
Použití α-N-acetylgalaktosaminidasy jako nástroje vhodného pro syntézu komplexních oligosacharidových stimulátorů imunitního systému Úvod: Alfa-N-acetylgalaktosaminidasy jsou exoglykosidasy specificky štěpící terminálně vázaný α-N-acetylgalaktosamin v různých sacharidových řetězcích neboz aminokyselin serin nebo threonin. Tyto enzymy jsou široce rozšířené, vyskytují se téměř v každém organismu. Stabilita a aktivita v extremních podmínkách je důležitá vlastnost, které se hojně využívá při mnoha průmyslových aplikací. Studium velkého množství extracelulárních α-N-acetylgalaktosaminidas izolováných z vlaknitých hub byl nalezen nejlepší producent Asperillus niger CCIM K2. Enzym izolovaný z vlaknité houby Aspergillus niger vykazoval jedinečné vlastnosti, které byly dále zkoumány. Metody: Alfa-N-acetylgalaktosaminidasa izolována z A.niger byla částečně sekvenována pomocí Edmanova odbourávání a MALDI MS. Na základě zjištěných sekvencí byly navrženy degenerované oligonukleotidy. Gen kódujíci α-N-acetylgalaktosaminidasu byl amplifikovan pomocí PCR. Jako templát byla použita cDNA izolovaná z A.niger. Získaný gen byl ligován do expresního vektoru pYES-2CT a rekombinantní protein byl exprimován v kvasinkovém expresním systému Saccharomyces cerevisiae. Byly optimalizovány podmínky exprese tohoto proteinu. Protein byl...
|
|
|
α-N-Acetylgalactosaminidase as a tools in the synthesis of complex oligosaccharide immune stimulators
Mrázek, Hynek ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Macek, Tomáš (oponent) ; Wimmerová, Michaela (oponent)
1 Univerzita Karlova Přírodovědecká Fakulta Katedra Biochemie Použití α-N-acetylgalaktosaminidasy jako nástroje vhodného pro syntézu komplexních oligosacharidových stimulátorů imunitního systému Autoreferát dizertační práce Mgr. Hynek Mrázek Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, Dsc. Praha 2011 2 Úvod Glykoproteiny jsou proteiny obsahující kovalentně vázané sacharidové struktury. Sacharidy můžou být připojeny k proteinovému řetězci dvojím způsobem: O-glykosidickou nebo N-glykosidickou vazbou. N-glykosidicky spojené sacharidy jsou vázany k aminokyselině asparaginu, zatím co O-glykosidicky vázané sacharidy jsou spojeny k aminokyselinám serinu nebo threoninu. V glykoproteinech vyšších obratlovců se převážně vyskytují N-glykosidicky vázané sacharidové struktury. V případě N-glykosylace je sacharidový řetězec přenesen na aminokyselinu asparagin, který se nachází v aminokyselinové sekvenci N-X-ST, kde X může být jakákoliv aminokyselina kromě prolinu. Zatímco syntéza N-glykoproteinů se řídí určitými pravidly, u syntézy O-glykoproteinů nebyla žádná taková pravidla pro zatím nalezena. Proteinové glykosylace, která je nejčastější posttranslační modifikací, se účastní velké množství enzymů a enzymových komplexů. Celý proces glykosylace probíhá v endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Glykosidasy hydrolasy Podle...
|
host ::
RSS.