|
|
Úloha Bmh proteinů v regulaci kvasničného enzymu neutrální trehalasy Nth1.
Macáková, Eva ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Žáčková, Markéta (oponent)
116 9. Souhrn Neutrální trehalasa 1 je kvasničný enzym z rodiny hydrolas, který katalyzuje štěpení trehalosy na dvě molekuly glukosy. Trehalosa je neredukující disacharid, který slouží v buňkách kvasinek jako zdroj uhlíku a také jako stresový metabolit. Buňka v teplotním či chemickém stresu nahromadí trehalosu, které je v rámci zotavení se po ukončení stresových podmínek hydrolyzována trehalasou. Předmětem našeho výzkumu byla Nth1 ze S. cerevisiae. Jak bylo publikováno dříve (Panni, S., et al., 2008), Nth1 musí být fosforylována PKA a v přítomnosti kvasničné isoformy proteinu 14-3-3, aby byla aktivní. Aktivita také v menší míře vzroste v přítomnosti iontů Ca2+ (Franco, A., et al., 2003). Proteiny 14-3-3 jsou kyselé regulační proteiny, které se vyskytují ve všech eukaryotických organismech a účastní se řady buněčných dějů, jako je regulace buněčného cyklu, buněčný metabolismus, tranksripce, apoptosa a další. Proteiny 14-3-3 mají přes 400 známých vazebných partnerů, mezi které patří transkripční faktory, signalizační molekuly, enzymy a další. Své vazebné partnery regulují skrze fosforylované vazebné motivy, a to změnou jejich konformace, odkrýváním či zakrýváním specifické sekvence či zprostředkováním protein-protein interakcí. Proteiny 14-3-3 se vyskytují v mnoha isoformách v různých organismech, v...
|
|
|
Studium faktorů ovlivňující vazebnou specifitu 14-3-3 proteinů.
Veisová, Dana ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
111 10. Souhrn Proteiny 14-3-3 jsou dimerní molekuly s charakteristickým tvarem a velikostí okolo 30 kDa vyskytující se ve všech eukaryotických organismech. Zastávají klíčové role v rozmanitých buněčných procesech, jako jsou signalizace, buněčné dělení, apoptóza atd. C-koncový segment lidské isoformy proteinu 14-3-3ζ zastává důležitou autoinhibiční úlohu, kdy se v nepřítomnosti vazebného partnera váže do vazebného žlábku tohoto proteinu, a tím zároveň brání vazbě nevhodných ligandů. Struktura C-koncového segmentu nebyla dosud identifikována v žádné z publikovaných krystalových struktur. Oblast C-koncového segmentu je, na rozdíl od helikální oblasti α1-α9, sekvenčně vysoce variabilní. Usuzuje se, že C- koncový segment je velmi flexibilní a může zaujímat řadu různých konformací. Kvasničné isoformy proteinů 14-3-3 Bmh1 a Bmh2 se vyznačují významně delším C-koncovým segmentem s neznámou funkcí obsahující polyglutaminové sekvence. Úloha C-koncových částí kvasničných proteinů Bmh1 a Bmh2 byla prostudována rozmanitými biofyzikálními technikami. Měření dynamického rozptylu světla, sedimentační rychlosti, časově rozlišeného dohasínání anizotropie fluorescence a gelové permeační chromatografie naznačují zdánlivou, významně větší velikost molekul proteinů Bmh1 a Bmh2 v porovnání s lidskou isoformou 14-3-3ζ. Z tohoto...
|
|
|
Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů
Kaniaková, Martina ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Chaloupka, Roman (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Název práce: Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů Autor: Mgr. Martina Kaniaková Katedra / Ústav: Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Vedoucí disertační práce: RNDr. Jan Krůšek, CSc., Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Abstrakt: Nikotinové acetylcholinové receptory (nAChR) jsou ligandem otevírané iontové kanály. Jejich funkční vlastnosti a možnosti farmakologického ovlivnění jsme studovali prostřednictvím techniky terčíkového zámku (patch-clamp) v konfiguraci měření proudu z celé buňky. Zkoumali jsme vlastnosti neuronálních receptorů heterologně exprimovaných v linii COS buněk a svalových receptorů přirozeně exprimovaných buněčnou linií TE671. Lobelin, rostlinný alkaloid s dlouholetou historií terapeutického využití, je schopen přímé interakce s nikotinovými acetylcholinovými receptory ve vazebném místě pro agonistu. Zjistili jsme, že výsledný účinek této interakce je závislý na aplikované koncentraci lobelinu, přítomnosti dalšího agonisty, časovém schématu aplikace a v neposlední řadě na podtypu receptoru. Souhrnně lze lobelin označit za velmi slabého parciálního agonistu nAChR s výraznou schopností desensitizovat některé podtypy receptorů. V kombinaci s jinými agonisty lobelin účinkuje buď jako kompetitivní antagonista nebo koagonista. Pomocí bodových mutací jsme...
|
|
|
Adenylát cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis, jeho konformace a iontová rovnováha v hostitelské buňce.
Motlová, Lucia ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát-cyklázový (CyaA, ACT) toxin je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis. Ačkoli se CyaA váže na mnoho typů membrán, předpokládá se, že jeho receptorem je integrin CD11b/CD18, který je exprimován na povrchu myeloidních buněk. CyaA patří do rodiny RTX toxinů-hemolyzinů. CyaA působí na hostitelské buňky dvěma na sobě nezávislými aktivitami. Jednou z nich je přeměna ATP na cyklické AMP, kterou zajišťuje adenylát-cyklázová (AC) doména po translokaci do cytozolu hostitelské buňky, při které dochází ke vstupu vápenatých kationtů do hostitelské buňky. Translokace je pravděpodobně iniciována interakcí monomeru CyaA s cílovou membránou. Druhá aktivita CyaA je tvorba kanálu, selektivního pro kationty, který může způsobit koloidně osmotickou lyzi cílových buněk. Kanálo-tvorná aktivita je zajišťována RTX hemolyzinovou doménou a předpokládá se u ní oligomerizace, i když bylo zjištěno, že únik draselných kationtů z hostitelské buňky způsobuje CyaA ve formě monomeru. Také není jasné, zda by k oligomerizaci CyaA docházelo v roztoku, nebo až po interakci s hostitelskou membránou. Cílem této práce bylo zkoumat tok sodných iontů na membráně myších makrofágů J774A.1, které na svém povrchu exprimují CD11b/CD18 integrin. Pro dosažení tohoto cíle byly použity fluorescenční metody....
|
|
|
Vliv první transmembránové domény na kinetiku desenzitizace P2X4 receptoru.
Kalasová, Ilona ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Extracelulární adenosin-5'-trifosfát (ATP) je důležitou signální molekulou. Buňky prakticky všech tkání eukaryotických organismů řízeně uvolňují ATP a exprimují i odpovídající purinergní receptory. Ionotropní P2X receptory jsou trimerní iontové kanály propustné pro K+, Na+ a Ca2+ kationty. Jedna podjednotka P2X receptoru se skládá ze dvou transmembránových domén (TM1 a TM2), velké extracelulární smyčky a intracelulárních konců. Transmembránová část receptoru je tak tvořena šesti helikálními doménami. Podle krystalové struktury zfP2X4 receptoru jsou TM1 helixy orientovány periferně a stabilizují TM2 helixy tvořící zátku póru. Elektrofyziologické studie ale naznačují, že se TM1 může podílet i na otevírání a zavírání receptoru a tvorbě iontového póru. V této práci byla zkoumána úloha TM1 v procesu desenzitizace potkaního P2X4 receptoru metodou cysteinové skenovací mutageneze. Byla identifikována dvě rezidua TM1 (Asn32 a Tyr42), jejichž mutace prodlužují dobu desenzitizace P2X4 receptoru. Pokusy s parciálním agonistou α,β-methylenadenosin-5'-trifosfátem (αβ-meATP) prokázaly, že změna konformace TM domén v procesu desenzitizace je nezávislá na konformačních změnách způsobených navázáním agonisty. Konzervovaný Tyr42 se nachází v blízkosti TM2 sousední podjednotky, pravděpodobně interaguje s Met336 a ovlivňuje tak...
|
|
|
The role of angiotensin receptors in neuropathic pain
Kalynovska, Nataliia ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Neuropatická bolest je jednou z chorob významně poškozujících pacienty. V současnosti dostupná léčba neuropatické bolesti je stále neúspěšná, neboť má pouze omezený léčebný efekt a pacienti trpí nežádoucími vedlejšími účinky. Zdá se, že vyšší účinnost by mohly vykazovat léčebné postupy založené na mechanismech vzniku neuropatické bolesti. Objasněním patologických mechanismů neuropatické bolesti se proto zabývá řada studií. Jedním z mechanismů, které mohou způsobovat neuropatickou bolest, je neuroinflamace. Nedávné studie naznačují, že angiotensin II (hlavní efektorová molekula renin- angiotensinového systému) může být zapojen v procesu neuroinflamace prostřednictvím svých receptorů v centrální nervové soustavě. Cílem této práce bylo za použití animálního modelu zjistit úlohu angiotensinových receptorů typu 1 na rozvoj a průběh neuropatické bolesti. Jako model periferní neuropatie jsme použili podvázání míšního nervu (SNL, L5). Naše výsledky prokázaly, že aplikace losartanu, působícího jako blokátor AT1R, výrazně snížila tepelnou hyperalgezii a omezila zvýšenou sensitivitu vůči mechanickým podnětům u SNL-operovaných potkanů. To naznačuje možnou úlohu AT1 receptorů v rozvoji neuropatické bolesti, pravděpodobně díky snížení neuroinflamace v nervovém systému po poškození nervu. Tyto poznatky a další studie...
|
|
|
Srovnání fluorescenčních sond disC3(3) a diSC3(5) z hlediska jejich použitelnosti při měření změn membránového potenciálu kvasinek.
Matunová, Petra ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Membránový potenciál představující napětí na membráně je důležitý parametr pro studium buněčných procesů. Pomocí karbocyaninových sond diS-C3(3) a diS-C3(5), označovaných společným názvem 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide, lze monitorovat změny membránového potenciálu buněk, které jsou příliš malé pro zavedení mikroelektrod. Tyto změny lze sledovat v jednotkách mV. Spektrální analýza buněčných suspenzí kvasinek S. cerevisiae s fluorescenčními sondami umožňuje stanovit koncentrace extracelulárního a intracelulárního fluorescenčního barviva, z jejichž znalosti lze určit hodnoty změn membránového potenciálu, které je možné vyvolat vnějšími podněty. Součástí práce je porovnání akumulace obou fluorescenčních sond a také experimenty zacílené na sledování vlivu vybraných látek a jejich měnících se koncentrací na volnou a vázanou složku barviva.
|
|
| |
|
|
Studium exprese MDR pump u kvasinek Saccharomyces cerevisiae za různých růstových podmínek: metoda s fluorescenční sondou diS-C3(3)
Zahumenský, Jakub ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
V tejto práci sme študovali dva kvasinkové transportéry z rodiny ABC, Pdr10p a Pdr15p. V čase zadania diplomovej práce sa verilo, že tieto proteíny prispievajú ku kvasinkovému MDR fenotypu (PDR) na základe ich vysokej homológie s iným kvasinkovým MDR proteínom, Pdr5p. Aby sme tieto pumpy mohli študovať, boli pripravené dve izogénne skupiny mutantných kmeňov s deletovanými génmi kódujúcimi tieto proteíny, vo všetkých možných kombináciách delécií. Ukázalo sa, že oba tieto proteíny sú veľmi dôležité pri udržiavaní normálneho mikrookolia plazmatickej membrány pre najhojnejší, a esenciálny, kvasinkový membránový proteín, H+ -ATPázu, a tak ovplyvňujú membránový potenciál. Proteíny Pdr10p a Pdr15p tak hrajú doposiaľ neznámu úlohu pri regulácii tohoto enzýmu. Ďalej sa ukázalo, že delécia génov kódujúcich tieto proteíny výrazne znižuje možnosť aktivácie H+ -ATPázy protonofórom CCCP, ktorý je slabou kyselinou. Štúdie s imunosupresantom FK506 ďalej ukazujú, že táto látka znižuje životaschopnosť mutantného kmeňa S. cerevisiae PLY643, ktorý má deletované gény kódujúce Pdr5p, Snq2p a Yor1p. Ďalšie delécie Pdr10p a Pdr15p nezvyšujú letalitu tejto látky. Ani FK506 ani CCCP nie sú substrátmi študovaných púmp. 1
|
|
|
Calcium homeostasis and modulation of nociceptive synaptic transmission
Sojka, David ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Žurmanová, Jitka (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
3 transient induced by control dorsal root stimulation. Using this model together with transgenic labeling of specific neuronal populations could be useful in the future, especially for pharmacological testing of new analgesic drugs. SOUHRN PRÁCE Předkládaná disertační práce má za cíl přispět k objasnění míšních mechanismů nocicepce. Jedním z důležitých mechanismů podílejících se na vzniku a průběhu řady chronických bolestivých stavů je tzv. centrální sensitizace. Jedná se o formu dlouhodobé modulace synaptického přenosu na míšní úrovni, neboli synaptické plasticity. Tato studie se ve své hlavní části zabývá vývojem metody, která by s využitím techniky Ca imagingu umožnila studovat mechanismy centrální sensitizace in vitro na populaci neuronů zadního míšního rohu. V pokusech provedených na akutních míšních řezech jsme snímali změny fluorescence u Ca-senzitivní sondy FLUO-4 v neuronech zadního míšního rohu. Analýza změn intracelulární koncentrace Ca, ke kterým docházelo během synaptického přenosu vyvolaného stimulací zadního kořene míšního, odhalila dva odlišné typy Ca odpovědí. První typ odpovědi byl synchronizovaný s elektrickou stimulací, zatímco druhý typ, odpovídající uvolnění Ca z vnitřních Ca zdrojů, následoval po určité časové prodlevě po stimulaci. Tyto pozdní Ca odpovědi, nezávislé na aktivaci...
|
host ::
RSS.