|
| |
|
|
Studie o účinku ivermektinu na purinergní P2X4 receptor
Jelínková, Irena ; Teisinger, Jan (vedoucí práce) ; Šťastný, František (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
P2~ receptor je iontový kanál, jehož ligandem je ATP. Je to jediný savčí purinergní receptor, který může být modulován působenim extracelulárně aplikovaného ivennektinu (IVM). IVM je alosterický modulátor, který zvyšuje citlivost P2~ receptoru k agonistům, potencuje maximálni proudové odpovědi a prodlužuje dobu deaktivace kanálu po od mytí agonisty. V této studii jsme se pokusili lokalizovat vazebné místo pro IVM a pomocí jeho pozitivního alosterického účinku získat nové infonnace o vztahu struktury a funkce P2~ receptoru. Nejdříve jsme se zaměřili na identifikaci oblastí P2X4 receptoru a jednotlivých aminokyselinových zbytků, které se podílejí na úč incích IVM na otevírání kanálu. K tomuto účelu jsme využili různé chimémí receptory P2X2 a P2~ receptorů a dále také řadu bodových mutantních receptorů. Experimenty s chimérními receptory ukázaly, že extracelulární sekvence V 49-V61, ale ne sekvence V64-Y315, je důležitá pro účinek IVM na deaktivaci kanálu. Receptor-specifické mutace v oblasti trans membránových domén G29-V61 a N338-L358 ukázaly, že také zbytky W50, V61 a V357 hrají roli v účinku IVM na deaktivaci kanálu. Následně jsme také testovali význam všech z bytků v oblasti transmembránových domén. Výsledky cysteinové skenovací mutageneze po dpořily naši domněnku o významu zbytku W50 a dále také odhalily...
|
|
| |
|
|
Exprese cholinergního genového místa u myšího modelu Alzheimerovy nemoci
Zimčík, Pavel ; Doležal, Vladimír (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
(český jazyk) V současné době nejběžnější senilní demence, Alzheimerova choroba (AD), je charakterizována postižením paměti a vyšších kognitivních funkcí. Typickými post-mortem nálezy na mozcích pacientů s AD jsou extracelulární amyloidní plaky, intracelulární neurofibrilární klubíčka a poškozené cholinergní i ostatní neurotransmiterové systémy. Do dnes není známo spojení mezi poškozeným centrálním cholinergním systémem a hromaděním beta-amyloidu. Naše experimenty se zaměřily na parietální kůru sedmiměsíčních APPswe/PS1dE9 transgenních myší, v jejichž mozcích dochází k vysoké produkci amyloidních fragmentů. Cholinerní synapse těchto myší vykazují funkční presynaptické (stimulované uvolňování acetylcholinu) i postsynaptické (aktivace G-proteinů muskarinovými receptory) poruchy a úbytek cholinergních markerů. Pomocí qPCR jsme stanovili hodnoty exprese mRNA pro cholinacetyltransferázu, váčkový přenašeč pro acetylcholin a M1-M4 podtypy muskarinových receptorů u transgenních a kontrolních myší ze stejného vrhu. Získané hodnoty exprimované mRNA se u žádného genu signifikantně nelišily. Tyto výsledky ukazují, že úbytek cholinergních proteinů je důsledkem dějů na posttranskripční úrovni.
|
|
|
Mechanizmy aktivace a modulace TRPV1 receptoru: vztah struktury a funkce
Touška, Filip ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Vaniloidní receptor typu 1 - TRPV1 - je jedním z významných iontových kanálů z rodiny teplotně aktivovaných TRP receptorů, které se podílejí na integračních mechanizmech transdukce nociceptivních signálů v periferním nervovém systému. Na primárních aferentních senzorických neuronech je TRPV1 aktivován podněty chemickými (např: kapsaicin, reziniferatoxin, mediátory zánětu, endogenní vaniloidy, snížení pH < 6.5) a teplotními (nad 43 řC). Kromě zvýšené exprese na neuronech ganglií zadních kořenů míšních a trigeminálních gangliích byla potvrzena funkční exprese TRPV1 receptoru také v některých vyšších strukturách CNS. Strukturálně-funkční studie v průběhu posledních 13 let, které uplynuly od naklonování tohoto polymodálního iontového kanálu, odhalily řadu specifických vlastností, zůstává však také mnoho nezodpovězených otázek, převážně týkajících se buněčných mechanizmů regulace aktivity, modulace a komplexní funkce v nervovém systému. Cílem diplomové práce bylo pomocí elektrofyziologických a fluorescenčních technik charakterizovat časový průběh aktivace a desenzitizace rekombinantního TRPV1 receptoru ve vztahu k dynamickým změnám intracelulární koncentrace Ca2+. Na základě toho stanovit protokol a hlavní parametry těchto dějů, na které se zaměřila následná strukturálně-funkční analýza. Jedním z hlavních úkolů...
|
|
|
Studium interakce C-konce DNA-vazebné domény FOXO4 s DNA
Zusková, Iva ; Teisinger, Jan (oponent) ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce)
Forkhead transkripční faktory jsou strukturně příbuzné molekuly obsahující přibližně 110 aminokyselin-velkou konzervovanou DNA-vazebnou doménu známou jako forkhead doména. Protein FOXO4 náleží do podskupiny "O" forkhead transkripčních faktorů. Zástupci podskupiny FOXO forkhead transkripčních faktorů se podílejí na mnoha důležitých biologických procesech. FOXO faktory se účastní kontroly metabolismu, buněčného cyklu, apoptózy a ochrany vůči oxidativnímu stresu. DNA-vazebná doména členů FOXO se skládá ze tří α-helixů (H1, H2 a H3), tří β-vláken (S1, S2 a S3) a dvou flexibilních ohybů (nazývaných jako křídla W1 a W2). Úloha ohybu W2 při vazbě FOXO na DNA je nejasná. Ohyb W2 pravděpodobně interaguje s oblastí DNA předcházející hlavní vazebný motiv FOXO faktorů. Spekuluje se, že vazebná afinita DNA-vazebné domény FOXO4 k DNA roste s obsahem A-T párů v oblasti DNA předcházející hlavní vazebný motiv. Pro ověření této hypotézy byla exprimována a purifikována DNA-vazebná doména FOXO4 a byla určena její vazebná afinita ke třem různým DNA duplexům lišících se obsahem A-T párů v oblasti před hlavní vazebnou sekvencí. Vazebná afinita byla určena pomocí měření změn stacionární anisotropie fluorescence. Toto stanovení neukázalo žádné signifikantní rozdíly mezi vazebnou afinitou DNA-vazebné domény FOXO4 k DNA o...
|
|
|
Úloha deseti ektodoménových cysteinových zbytků ve funkci P2X4 receptoru stimulovaného ATP
Tvrdoňová, Vendula ; Teisinger, Jan (oponent) ; Zemková, Hana (vedoucí práce)
Mimobuněčný adenosin-5'-trifosfát (ATP), uvolňovaný z poškozených buněk nebo sekretovaný ze synaptických váčků, působí na své membránové receptory nazývané purinergní. Purinergní P2X receptory jsou iontové kanály aktivované ATP. Dosud bylo u savců identifikováno sedm P2X podjednotek, označených jako P2X1-7. Všechny podjednotky mají podobnou strukturu, kterou tvoří velká ektodoménová klička, dvě transmembránové domény a vnitrobuněčné N- a C- konce. Dalším společným rysem jsou konzervované aminokyseliny, mezi něž patří i deset cysteinových zbytků v ektodoménové kličce. Všechny ektodoménové cysteiny tvoří disulfidické můstky, které jsou uspořádány do dvou polovin, tři disulfidické můstky jsou v N-koncové části a dva jsou v C-koncové části ektodomény. P2X receptory jsou organizovány jako homoméry nebo heteroméry tří podjednotek. ATP vazebná kapsa se nachází mezi dvěmi sousedními podjednotkami. Cílem diplomové práce bylo prozkoumat úlohu ektodoménových cysteinů nebo disulfidických můstků ve funkci a tvorbě P2X4 receptoru a jeho citlivosti k ATP. Všech deset cysteinů, jeden po druhém, bylo nahrazeno alaniny a ATP-stimulované proudy byly snímány z HEK293 buněk nesoucích divoký typ P2X4 receptoru a jeho mutanty. Pro další výzkum nefunkčních nebo málo funkčních mutací (C126A, C149A, C217A, C227A, C270A) byl...
|
|
| |
|
| |
|
|
Úloha proteinů CIDE při apoptóze a morfologie mitochondriální sítě v patogeneze
Šantorová, Jitka ; Ježek, Petr (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent) ; Kalous, Martin (oponent)
Souhrn CIDEa (Cell death-inducingDFFIDNA fiagmentationfactor].likeeffector.a)je protein,ktenýmuže iniciovat apoptózuskze narušeníheterodimeríckéhoproteinuDFF, sloŽenéhoz nukleáayDFF40, kteroualdivuje kaspáza3 ajejiho inhibitoruDFF45. Měřili jsme hladiny mRNA CiDEa v tkáních laboratorníhopotkana a detekovalj tento protein ve lysohých hladinách v bílétukovétkani. Potvrdili jsme také přítomnost proteinu CIDEa v mrtochondriícha důležitostjeho CIDE-C doménypro tuto lokalizaci. Ukiízalo se, že mýšenáexpreseproteinuCIDEa vedla kapoptóze' Dále jsme provedli imunodetekci buněčnýchfrakcí HeLa buněk upravenýchna tetracyklinem indukovanou expresi. Po inkubací s campthotecinemnebo valinomycinem jsme s]edovali redistribuciproteinu CIDEa do jádra. Předpokládáme,žeCIDEa se nacházív mitochondriícha jejítransportdojádra můžezesílitneboiniciovat mechanismusapoptóZy' Mitochondrietvořív buňkáchretikularnistruktury,kterékontinuálněprocháaejíprocesyfúzea fragnentace. Doposud provedenétrojrozměméanalýzy mítochondriíale nepopsaly detaílně jejich strukturu' Analyzovali jsme mitochondriální síťu buněčnýchlinii INSIE a }iEPG2 traďekovaných mitochondriálněadresovanýmGFP. Pomocí4Pi mikoskopie se mohou sledovat přesnézměny v 3D struktuře, odpovídajícízměnám energetickýchstavův buňkách' a to při rozlišeníl00nm. Mitochondrie INSlE buněkza...
|
host ::
RSS.