|
|
Characterization of the role of SPINK 6 in the epidermis using transgenic models
Buryová, Halka ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Epidermis tvoří bariéru mezi vnitřním a vnějším prostředím, přičemž celková homeostáze je závislá mezi jiným i na správné obměně keratinocytů. Podstatnou úlohu hrají v tomto procesu serinové proteázy a jejich inhibitory. Aktivované proteázy štěpí desmosomy ve svrchní vrstvě epidermis a umožňují tak odlupování keratinocytů. V nižších vrstvách epidermis jsou proto vylučovány proteázové inhibitory, jejichž funkcí je zabránit předčasné aktivaci proteáz, a tím rozrušení epidermální bariéry. Mezi nejznámější inhibitory v epidermis patří inhibitory serinových proteáz kazálního typu (SPINK). Tato práce je orientována na výzkum myšího SPINK6 in vivo. K tomu účelu jsme pomocí modifikovaného lidského involukrinového promotoru vytvořili transgenní myši exprimující mSPINK6 ve zvýšené míře, přičemž vyšší expresi mSPINK6 na mRNA a proteinové úrovni RNA vykazovaly dvě z pěti trasngenních linií. Ukázali jsme, že transgenní zvířata jsou životaschopní jedinci bez zjevného fenotypového projevu. Na makroskopické úrovni jsme pak popsali mírný fenotyp, který odlišuje transgenní mSPINK6 myši od normálních jedinců. Závěrem lze říci, že mSPINK6 hraje v homeostázi kůže nejspíš pouze minoritní roli, naproti tomu však může být velmi důležitý při specifické obměně epidermální bariéry. Námi připravené mSPINK6 trasngenní myši mohou být...
|
|
|
Vliv acyklických nukleosidfosfonátů PMEG a PMEDAP na p38 kinasovou signalizaci v lidských leukemických buňkách
Nejedlá, Michaela ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Slaninová, Jiřina (oponent)
PMEG [9-(2-fosfonometoxyetyl)guanin] a PMEDAP [9-(fosfonometoxyetyl)-2,6- diaminopurin] jsou acyklické nukleosidfosfonáty se zvýrazněným cytotoxickým účinkem. Antiproliferační aktivita látky PMEG byla demonstrována in vitro na řadě nádorových buněčných linií. PMEG je také účinnou látkou několika experimentálních proléčiv vynikajících selektivitou a výborným protinádorovým účinkem (např. GS-9219). PMEDAP v in vitro experimentech sice nedosahuje účinnosti PMEG, prokázal však silný protinádorový účinek na modelu SD-potkanů se spontánními lymfomy, proto byl rovněž zařazen do této studie. Cílem práce bylo na modelu buněčných linií CCRF-CEM a HL-60 popsat interakce PMEG a PMEDAP s p38-MAP-kinasovou signalizací a její vztah k apoptose. Byl zkoumán vliv těchto látek na expresi genů kódujících čtyři isoformy p38-MAPK a dále zda se tato změna projeví na úrovni proteinu. Bylo zjištěno, že PMEG zvyšuje expresi mRNA pro p38β, γ v buněčné linii CCRF-CEM a isoforem β, δ v buněčné linii HL-60, efekt PMEDAP je v porovnání s PMEG slabší. Celkové množství proteinu pro p38 však nebylo účinkem PMEG a PMEDAP ovlivněno. Dále byl sledován vliv PMEG a PMEDAP na aktivaci p38-kinasové dráhy pomocí protilátky proti fosforylované formě p38. Bylo zjištěno, že ani jedna z látek kinasovou dráhu neaktivuje. Výsledky se nelišily...
|
|
|
Gangliosidy v játrech u cholestázy indukované podvázáním žlučovodu.
Hynková, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Ledvinová, Jana (oponent)
Gangliosidy patří mezi sfingolipidy obsahující kyselinu sialovou. Nachází se na buněčném povrchu všech typů živočišných buněk. Zde plní funkci receptorových molekul, dále se účastní mezibuněčných interakcí a díky své rigidní struktuře zpevňují buněčnou membránu a chrání tak buňku před škodlivými okolními vlivy. Tato diplomová práce studuje vliv experimentální cholestázy na složení gangliosidů jaterní tkáně. Cholestáza byla vyvolána podvazem žlučovodů u potkanů kmene Wistar. V játrech zvířat s cholestázou ve srovnání s kontrolami byl zjištěn signifikantní nárůst celkové lipidní kyseliny sialové a gangliosidů b-série (GD1b, GT1b event. GD3). Tyto výsledky zjištěné u obstrukční cholestázy odpovídají výsledkům které publikoval Majer a spol. Biomed. Chromatogr., 21, 446-450 (2007) u cholestázy vyvolané 17ethinylestradiolem, ale nárůst gangliosidů b-série je v naší studii mírnější. Dále tato práce zkoumala vliv modulace aktivity hemoxygenasy 1 (HO-1) při cholestáze vyvolané podvazem žlučovodů (hemin jako aktivátor HO-1, Sn-mesoporfyrin jako inhibitor HO-1) na složení gangliosidů. U skupin zvířat s podávaným Sn-mesoporfyrinem bylo zjištěno zvýšení celkové kyseliny sialové, zatímco složení gangliosidů zůstalo nezměněno. U skupin zvířat s heminem aktivovanou HO-1 nebyla zvýšená celková lipidně vázaná...
|
|
| |
|
| |
|
|
Enterohepatic circulation of bilirubin
Zelenka, Jaroslav ; Vítek, Libor (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Červinková, Zuzana (oponent)
Bilirubin, hlavní produkt degradace hemu, působí fyziologicky jako antioxidant, zatímco ve vysokých koncentracích může být neurotoxický. Z těla je vylučován jako součást žluči do střeva, kde zůstává vázán na střevní obsah a je postupně metabolizován střevní mikroflórou. Část bilirubinu je resorbována zpět do oběhu a prochází tzv. enterohepatální cirkulací (EHC). Náplní této disertační práce je studium metabolismu a EHC bilirubinu. Bilirubin se ve střevě váže s dvoumocnými kationty a tím je utlumena jeho EHC. Nicméně případné terapeutické podávání takových látek může ovlivnit metabolismus anorganických iontů v těle. Výsledky naší první studie ukazují, že pokud byly Gunnovy krysy s vrozenou hyperbilirubinémií krmeny nerozpustným metakrylanem zinečnatým, jejich hladiny sérového bilirubinu poklesly, zatímco koncentrace zinku v krvi zůstala nezměněna a zároveň se neobjevily žádné patologické změny trávicího traktu. EHC bilirubinu je významně ovlivněna také rychlostí redukce bilirubinu střevní mikroflórou, především bakteriemi rodu Clostridium. V naší druhé studii jsme na Gunnových krysách prokázali, že antibiotická terapie vedoucí k eliminaci střevních klostridií vedla k významnému vzrůstu hyperbilirubinémie, zatímco následná kolonizace kmenem C. perfringens s vysokou aktivitou enzymů redukujících bilirubin...
|
|
| |
|
|
Vliv volných radikálů na stárnutí
Lukšanová, Hana ; Wilhelm, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Macháčková, Ivana (oponent)
Cílem této studie bylo ověřit platnost Harmanovy teorie stárnutí, založené na působen í volných ra dikálů, na nových modelech stárnutí rostlin a kvasinek, jelikož tyto organizmy byly nedávno přijaty mezinárodní komunitou jako uznávané modely pro studium mechanizmu stárnutí na molekulární úrovni. Vzhledem k tomu, že v Harmanově teorii stárnutí má centrální význam endogenní produkce volných radikálů, zaměřila jsem se ve své studii na sledování časového průbě hu vzniku jejich koncových produktů . Paralelně jsem sledovala změny antioxid a ční ch systémů, které rozhodují o rozsahu poškození vyvolaném volnými radikály. V poslední době se ukazuje, že procesů stárnutí se účastní i reaktivní slo u čen iny dusíku, a proto jsem zaměři l a pozornost i na mechanizmy zahrnující účast těchto sloučenin. Jako modelové organizmy jsem použila fazol (Phaseo/us vu/garis L.), trasgenní rostliny tabáku (Nicotiana tabacum L. ) s pozměněnou koncentrací cytokininů, husen íček rolní (Arabidopsis tha/iana) a kvasinky (Saccharomyces cerevisiae). Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Rekombinantní aspartátové proteasy krev sajících parazitů
Váchová, Jana ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Krev sající parazité klíště obecné Ixodes ricinus a krevnička střevní Schistosoma mansoni produkují trávicí aspartátovou proteasu typu katepsinu D, která zahajuje degradaci hemoglobinu, jež je jejich hlavním potravním zrojem. Pro katepsin D z I. ricinus (IrKatD) byl sestaven a optimalizován protokol pro refolding rekombinantního enzymu a byl určen způsob aktivace IrKatD, při níž zymogen odštěpuje propeptid auto-aktivačním mechanismem v kyselém pH. Dále byly studovány funkční vlastnosti IrKatD s využitím kinetického měření v přítomnosti fluorogenního substrátu. Takto bylo určeno pH optimum, substrátová a inhibiční specificita IrKatD. V práci byla dále popsána příprava dvou izoenzymů rekombinantního katepsinu D ze S. mansoni (SmKatD). Pro jejich produkci byl použit expresní systém E. coli. Produkované proteiny byly izolovány z inkluzních tělísek pomocí afinitní chromatografie za denaturačních podmínek a byl sestaven a optimalizován protokol pro jejich refolding. Studované aspartátové proteasy jsou zajímavé z medicinálního pohledu: inhibitory SmKatD představují potenciální chemoterapeutika pro léčbu schistosomosy a IrKatD je perspektivní antigen pro vývoj nových protiklíštěcích vakcín.
|
|
|
Katepsin L z klíštěte obecného (Ixodes ricinus)
Talacko, Pavel ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Klíšťata patří mezi významné parazity člověka, kteří přenášejí řadu patogenů. V Evropě je hlavním druhem klíště obecné Ixodes ricinus přenášející bakterii Borrelia burgdorferi (způsobující Lymskou boreliosu) a vir klíšťové encefalitidy. Při trávení proteinů z krve hrají důležitou roli katepsinové proteasy v žaludku klíštěte. Tato práce se zabývá katepsinem L, který je znám jako významná cysteinová trávící proteasa klíšťat. Byl připraven rekombinantní katepsin L z I. ricinus, který byl chromatograficky izolován z kultivačního media expresního systému Pichia pastoris. Izolovaný katepsin L byl charakterizován pomocí N-koncového proteinového sekvenování a pomocí značení fluorescenční aktivitní značkou Green-DCG-04. Analýza substrátové a inhibiční specifity katepsinu L pomocí peptidových substrátů a inhibitorů prokázala Z-FR-AMC jako vhodný substrát s pH optimem 3,5 a Z-FF-DMK jako účinný inhibitor. Byla zjištěna schopnost katepsinu L degradovat proteinové substráty HSA a hemoglobin v silně kyselém prostředí (pH 3,5-4,5). Proteolytická aktivita se stejnými charakteristikami jako byly určeny u rekombinantního katepsinu L byla identifikována v extraktu ze slinných žláz a ve slinách klíštěte I. ricinus. Jde o první nález katepsinové proteasy ve slinách klíšťat. Lze předpokládat, že katepsin L sekretovaný...
|
host ::
RSS.