|
|
Genome editing using programmable endonucleases
Hanečková, Radmila ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Sýkora, Michal (oponent)
Programovatelné endonukleázy jsou proteiny schopné rozpoznat specifické sekvence nukleotidů a následně v rozpoznané sekvenci štěpit obě vlákna DNA. Zinc-finger nukleázy jsou široce využívaným nástrojem v genomové editaci, metodě zavádění změn do genomů buněčných liní nebo celých organismů za účelem studia funkce genů. Nedávno se objevily nové typy programovatelných endonukleáz v podobě transcription activator-like effector (TALE) nukleáz a CRISPR/Cas systému. Tyto systémy se od sebe liší z pohledu mechanizmu funkce, dostupnosti, selektivity, frekvence off- targetů a cytotoxicity. V této práci zinc-finger nukleázy, TALE nukleázy a CRISPR/Cas systém porovnáváme a zkoumáme jejich aktuální a možné budoucí využití v široké oblasti výzkumu, který sahá od vývoje geneticky modifikovaných organismů až po genovou terapii. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Generation and analysis of mutant mouse models to study pathophysiological roles of KLK5 and KLK7 in epidermis
Kašpárek, Petr ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Stopka, Pavel (oponent) ; Machoň, Ondřej (oponent)
Peptidázy příbuzné kallikreinu (KLK) představují rodinu vzájemně spřízněných serinových proteáz, které jsou kódovány geny umístěnými v jediném chromozomálním lokusu. Jejich exprese byla popsána v mnoha tkáních a řada experimentů in vitro naznačuje významnou roli KLK v mnoha fyziologických i patologických procesech. Přesto jsou skutečné úlohy KLK v živém organismu stále ne zcela objasněny, což je způsobeno zejména nedostatkem vhodných zvířecích modelů pro jejich studium. Přestože genově-deficientní myší modely pro některé KLK již byly vytvořeny, jejich význam pro objasnění rolí těchto proteáz v komplexním prostředí živého organismu byl jen omezený. Jednou z hlavních překážek je částečný funkční překryv mezi některými KLK. Inaktivace jednoho genu tudíž často nevede ke změně fenotypu v důsledku funkční kompenzace mezi jednotlivými proteázami. Zdá se tedy, že klasické myší modely deficientní pro jeden gen jsou ne zcela vhodným nástrojem pro studium KLK in vivo. V této práci jsme použili TAL efektor nukleázy (TALENy) pro přípravu několika nových mutantních myších linií, které umožňují analýzu komplexních proteolytických sítí tvořených KLK a studium jejich role ve zdravém organismu i během chorobných procesů. Připravili jsme nový model pro Nethertonův syndrom (NS), autosomálně recesivní kožní chorobu způsobenou...
|
|
|
Vliv extracelulární matrix na expresi genů jaterních myofibroblastů
Jiroutová, Alena ; Kanta, Jiří (vedoucí práce) ; Ehrmann, Jiří (oponent) ; Sedláček, Radislav (oponent)
SOUHRN Jaterní hvězdicové buňky (HSC) a jaterní myofibroblasty (MF) jsou považovány za buňky odpovědné za syntézu extracelulární matrix (ECM). HSC a MF se liší lokalizací v jaterním lalůčku i expresí genů. HSC se nacházejí v Disseho prostoru, při poškození jater se aktivují, proliferují a přeměnují se na myofibroblastické buňky. MF jsou heterogenní skupina buněk, byly popsány portální pMF, septální sMF a interface iMF. V portobiliárním prostoru jaterního lalůčku se nacházejí pMF, které se aktivují při ischemii a městnání žluči; sMF se nacházejí uvnitř vazivových sept. Cílem naší práce bylo porovnat změny exprese genů, které provázejí aktivaci HSC in vitro se změnami odehrávajícími se v HSC při vzniku jaterní cirhózy v modelu toxického poškození jater. Expresi vybraných genů jsme sledovali pomocí oligo cDNA arrayí zahrnujících geny kódující proteiny, proteoglykany, cytokiny, růstové faktory a geny související s metabolismem pojiva - metaloproteinasy (MMP). Zajímali jsme se také o chování MF v trojrozměrném kultivačním prostředí - fibrinovém a kolagenním gelu, které lépe simuluje podmínky ve fibrotických játrech. Poškozená jaterní tkáň je nahrazována nejdříve plasmatickým fibrinem a posléze je nahrazena jizvou s převahou kolagenu. Chování a exprese genů MF v trojrozměrném kultivačním prostředí, nebyla dosud...
|
|
|
Characterization of the role of SPINK 6 in the epidermis using transgenic models
Buryová, Halka ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Epidermis tvoří bariéru mezi vnitřním a vnějším prostředím, přičemž celková homeostáze je závislá mezi jiným i na správné obměně keratinocytů. Podstatnou úlohu hrají v tomto procesu serinové proteázy a jejich inhibitory. Aktivované proteázy štěpí desmosomy ve svrchní vrstvě epidermis a umožňují tak odlupování keratinocytů. V nižších vrstvách epidermis jsou proto vylučovány proteázové inhibitory, jejichž funkcí je zabránit předčasné aktivaci proteáz, a tím rozrušení epidermální bariéry. Mezi nejznámější inhibitory v epidermis patří inhibitory serinových proteáz kazálního typu (SPINK). Tato práce je orientována na výzkum myšího SPINK6 in vivo. K tomu účelu jsme pomocí modifikovaného lidského involukrinového promotoru vytvořili transgenní myši exprimující mSPINK6 ve zvýšené míře, přičemž vyšší expresi mSPINK6 na mRNA a proteinové úrovni RNA vykazovaly dvě z pěti trasngenních linií. Ukázali jsme, že transgenní zvířata jsou životaschopní jedinci bez zjevného fenotypového projevu. Na makroskopické úrovni jsme pak popsali mírný fenotyp, který odlišuje transgenní mSPINK6 myši od normálních jedinců. Závěrem lze říci, že mSPINK6 hraje v homeostázi kůže nejspíš pouze minoritní roli, naproti tomu však může být velmi důležitý při specifické obměně epidermální bariéry. Námi připravené mSPINK6 trasngenní myši mohou být...
|
|
|
Generation of transgenic mouse model to study biological role of KLK5 in epidermis
Kašpárek, Petr ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent)
Klk5 patří mezi nejvýznamnější proteolytické enzymy v pokožce a podílí se na procesech jako je deskvamace, štěpení antimikrobiálních peptidů nebo indukce zánětlivé reakce. Role Klk5 v epidermis byla dosud popisována na základě experimentů in vitro, je proto nezbytné potvrdit jeho funkci in vivo. Tato práce si kladla za cíl vytvořit metodické postupy pro zacílení genové exprese myších kalikreinů do svrchní vrstvy pokožky a připravit transgenní myší model exprimující mKlk5 v pokožce. Prvním krokem byla příprava transgenních myší exprimujících fluorescenční marker tdTomato pod kontrolou upraveného involukrinového promotoru. Vytvořené transgenní myši vykazovaly expresi proteinu tdTomato výhradně ve svrchních vrstvách pokožky, čímž byla potvrzena vhodnost upraveného involukrinového promotoru pro cílení genové exprese do diferencovaných keratinocytů. Dále byly úspěšně připraveny transgenní myši exprimující mKlk5. Dvě transgenní linie vykazovaly 6-9 násobnou overexpresi mKlk5 na mRNA i proteinové úrovni v porovnání s wt zvířaty, transgenní mKlk5 byl ovšem za fyziologických podmínek přítomen pouze ve formě neaktivního zymogenu. Transgenní myši byly proto podrobeny dvěma modelům způsobujícím defekty v epidermální bariéře a potenciálně vedoucím aktivaci proteáz. Při modelu atopické dermatitidy a hojení ran...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Domamyslice. Pohřebiště lidu popelnicových polí
Sedláček, Radko ; Jiráň, Luboš (oponent) ; Bouzek, Jan (oponent)
Předkládaná publikace vychází z diplomové práce obhájené na Ústavu archeologie a muzeologie Masarykovy univerzity v Brně v r. 2002. Formálně práci tvoří publikace výzkumu pohřebiště kultury popelnicových polí v Domamyslicích, okr. Prostějov z let 1923-1939 a analýza získaného materiálu. Práce tak navazuje na původní a neúplnou publikaci podanou v minulém století A. Gottwaldem. Práce rozšířila počet známých hrobů na pohřebišti na 319 celků. Díky tomu vzrůstá i chronologické rozpětí nekropole, která byla souvisle užívána od konce R BD až do R HB3. V rámci pohřebního ritu byla pozorována řada jevů, např. existence tumulu lužické mohyly, jež byla v původní publikaci mylně interpretována jako žároviště. Lokalita byla začleněna do širších geografických souvislostí. Ty naznačují, že domamyslické pohřebiště přímo souvisí s nedalekým pohřebištěm v Seloutkách, jehož chronologické těžiště spočívá v lužickém a halštatském období lužického kulturního komplexu. Obě nekropole jsou tak místy posledního odpočinku obyvatel jediného mikroregionu, z něhož Domamyslice chronologicky pokrývají pouze jeho střední část s minimálně dvěma spíše však třemi poměrně samostatnými okrsky. Analýza materiálu obsaženého v hrobových celcích umožnila charakterizovat pohřebiště jako poměrně bohaté jak na keramiku tak bronzové předměty. I přes...
|
|
| |
host ::
RSS.