|
|
Nové způsoby isolace PHA z bakteriální biomasy
Dlouhá, Karolína ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá studiem izolace polyhydroxyalkanoátů pomocí komerčního surfaktantu a vybraných biosurfaktantů, kterými byly sophorolipidy, kokosové mýdlo, lecitin, lauryl glukosid, coco glukosid a cocamidopropyl betain. PHA bylo izolováno z bakterie Schlegelella thermodepolymerans DSM 15344, u které bylo nejdříve optimalizováno množství NaCl v produkčním médiu. Molekulová hmotnost izolovaného polymeru byla analyzována pomocí SEC-MALS, přičemž největší pokles molekulové hmotnosti byl zaznamenán u kokosového mýdla. Případné nečistoty v izolovaném polymeru byly analyzovány pomocí infračervené spektrometrie (ATR-FTIR), kdy nejmenší znečištění polymeru proteiny bylo zaznamenáno u kokosového mýdla. Z výše uvedených biosurfaktantů bylo vybráno kokosové mýdlo, lauryl glukosid a coco glukosid, s nimiž bylo získáno PHA o nejvyšší čistotě. Největší potenciál však mělo kokosové mýdlo. U vybraných biosurfaktantů byla optimalizována teplota izolace a koncentrace surfaktantu. Nejlepších výsledků bylo dosaženo při 90 °C a koncetraci 5 g/L. Dále byla zkoušena univerzálnost metody izolace pomocí vybraných biosurfaktantů na různých termofilních mikroorganismech, kterými byly Chelatococcus composti DSM 101465, Schlegelella thermodepolymerans DSM 15264, Tepidimonas taiwanensis LMG 22826 a Aneurinibacillus thermoaerophilus H1.
|
|
|
Evoluční inženýrství cyanobakterií v kontextu akumulace PHA
Vašířová, Kristýna ; Slaninová, Eva (oponent) ; Samek, Ota (vedoucí práce)
Cílem této diplomové práce bylo podrobit vybrané cyanobakteriální kmeny adaptivní evoluci a následně prozkoumat vlastnosti vzniklých adaptovaných kmenů, obzvlášť jejich změny týkající se akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Teoretická část práce blíže charakterizuje problematiku cyanobakterií, PHA a jejich vzájemné propojení v oblasti evolučního inženýrství. Pro evoluční experimenty byly použity cyanobakteriální kmeny Synechocystis sp. PCC 6803 a Synechocystis salina CCALA 192. Na vybrané zástupce byly vyvíjeny selekční tlaky působením peroxidu vodíku a mědi. Vzniklé kultury a jejich schopnost akumulace PHA byly následně posouzeny metodou plynové chromatografie. Oba tyto zvolené selekční tlaky se ukázaly jako nevhodné, jelikož po jejich aplikaci na kultury byla pozorována vysoká inhibice růstu neumožňující aplikace metod evolučního inženýrství. V druhé půlce experimentální části byly sledovány poskytnuté adaptované kmeny na 6% NaCl. Prokázalo se, že adaptace má na mikroorganismy pozitivní vliv, jelikož vykazovaly lepší růst biomasy, vyšší odolnost při odolávání stresovým podmínkám a bylo pozorováno nepatrné navýšení akumulace PHA.
|
|
|
Studium akumulace polyhydroxyalkanoátů u cyanobakterií
Pacasová, Viktorie-Alexandra ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce je zaměřená na studium vlivu vybraných stresových faktorů na produkci PHB u kmenů cyanobakterií Synechocystis sp. PCC 6803 a Synechocystis salina CCALA 192. Cyanobakterie byly kultivovány v multikultivátoru a jako stresový faktor byl použit zvýšený obsah soli (chloridu sodného) nebo směs acetátu a -butyrolaktonu v kultivačním médiu. Obsah PHB v jednotlivých cyanobakteriích byl stanovován pomocí plynové chromatografie, přítomnost a množství barviv byla stanovována pomocí extrakce barviv a pomocí přímé spektrofotometrické analýzy. Získané výsledky nepotvrdily hypotézu o zvýšení produkce PHB při kultivaci cyanobakterií v prostředí se zvýšeným obsahem soli. Příčinou tohoto zjištění je pravděpodobně společné působení několika stresových faktorů jako zvýšený obsah soli, kontinuální osvětlení v multikultivátoru a limitace dusíkem, díky použitému typu média, na kultury Synechocystis salina CCALA. Při kultivaci se směsí acetátu a -butyrolaktonu byly kultury analyzovány stejným způsobem, jako v případě prostředí se zvýšeným obsahem soli, a byla stanovována i přítomnost kopolymeru 3-hydroxybutyrátu a 4-hydroxybutyrátu. Během této kultivace byl rovněž pozorován pozitivní vliv kombinace působení kontinuálního osvětlení, typu média limitujícího dusík a výchozí koncentrace buněk v kulturách na rychlost růstu vybraných kmenů cyanobakterií.
|
|
|
Hydrogelové nosiče mikroorganismů v moderních environmentálních aplikacích
Súkeník, Martin ; Slaninová, Eva (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací kultivace a gelace bakterie rodu Azotobacter vinelandii patřící do skupiny PGPR, která je schopná syntetizovat intracelulární polyhydroxyalkanoáty a extracelulární alginát. Bakterií produkovaný alginát je síťován pomocí roztoku chloridu vápenatého za vzniku hydrogelového nosiče obsahující zmíněnou bakterii. Tento nekonvenční koncept enkapsulace bakterií přináší zjednodušení procesu výroby hydrogelových nosičů a širší uplatnění v moderních environmentálních aplikacích. V první části práce byly vybrány tři kmeny (DSM 85, 87 a 720), při kterých byla gravimetricky stanovena koncentrace produkovaného alginátu, jeho molekulová hmotnost byla určena technikou SEC-MALS a poměr M/G podjednotek byl analyzován technikou infračervené spektroskopie. Kmen Azotobacter vinelandii DSM 87 dosáhl při gravimetrickém stanovení nejvyšší koncentraci alginátu (4,9 ± 0,6) g/l v 5. den kultivace. Koncentrace produkovaného PHB se pohybovala v rozmezí 6 až 48 % CDW, která byla určena metodou plynové chromatografie. Nicméně nejlepší gelační vlastnosti vykazoval kmen DSM 720, který byl v druhé části práce použit na podrobnější optimalizaci kultivačních podmínek, a dále na analýzu tvorby gelů při rozdílné teplotě, čase gelovatění a různé koncentraci síťovacího činidla. Vytvořené gely byly porovnané reologickým měřením pomocí amplitudového a frekvenčního testu.
|
|
|
Metabolická a biofyzikální charakterizace bakteriálních buněk schopných akumulace PHA
Slaninová, Eva ; Lehocký, Marián (oponent) ; Doškař, Jiří (oponent) ; Chodak, Ivan (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená disertační práce se zabývá charakterizací bakteriálních buněk schopných akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou součástí příloh. Práce rozvíjí aktuální téma studia protektivních funkcí PHA a nově objasňuje některé protektivní mechanismy vůči vybraným stresorům. V rámci práce byly studovány protektivní účinky PHA granulí před UV zářením a osmotickým stresem, konkrétně hypotonickým prostředím. V případě expozice buněk UV zářením jsou buňky chráněny především díky rozptylu UV záření na granulích, které se vyskytují v těsné blízkosti nukleoidu. U osmotického stresu hraje klíčovou roli amorfní stav PHA granulí, který stabilizuje buněčné membrány při hypertonickém namáhání buněk, načež jsou bakteriální buňky lépe schopné odolávat přechodu do hypotonického prostředí a udržet si svoji buněčnou integritu. Obecně je možné konstatovat, že amorfní stav PHA granulí je klíčový pro zajištění správné biologické funkce PHA, ať už jako zásobního nebo protektivního polymeru. Proto jsme se v další části této práce věnovali objasnění podstaty stabilizačního mechanismu, který chrání nativní PHA granule před krystalizací a udržují tak intracelulární polymer v termodynamicky nevýhodném fázovém stavu. Na základě experimentálních poznatků, kde jsme aplikovali vybrané stresy, jsme navrhli nový model stabilizace amorfního stavu PHA granulí in vivo. Jedná se o kombinaci dvou mechanismů, kdy je z důvodu malého objemu granulí snížena rychlost krystalizace a zároveň voda přítomná v granulích plní roli nízkomolekulárního plastifikátoru. Díky metabolickému aparátu buněk jsou PHA neustále syntetizovány a zároveň degradovány, což vede k navýšení intracelulární koncentrace monomerů, které rovněž figurují v protektivním efektu PHA. V tomto kontextu jsme se tedy zaměřili na popis mechanismu kryoprotektivního účinku 3-hydroxybutyráru, monomeru nejrozšířenějšího zástupce PHA, poly(3-hydroxybutyrátu). Byl sestrojen rovnovážný a nerovnovážný fázový diagram systému 3HB-voda, díky kterému je možné konstatovat, že 3HB představuje velice efektivní kryoprotektant, což má fundamentální význam pro pochopení protektivních vlastností PHA, ale tato skutečnost může být také aplikačně využita například při úchově biologických vzorků anebo v potravinářském průmyslu.
|
|
|
production of PHA by selected extremophilic bacteria
Šarköziová, Patrícia ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor´s thesis deals with production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by thermophilic bacterial strains of Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii. We were finding out the best conditions for production of PHA granules inside the cells. In the beginning of the experiment we employed PCR to detect the phaC gene, encoding for PHA synthase, which is requisite for production of PHA. We also analyse the best source of carbon, optimal temperature for production of polyhydroxyalkanoates and influence of chosen precursors to grow of biomass and production of copolymers. The last part of this experimental thesis deals with research utilization of selected model hydrolysates. Glucose was the best source of carbon for both bacteria Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii and optimal temperature for grow and production of P(3HB) was 45°C. The applied precursors inhibited cell grow, but both bacterial strains Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii could produce copolymer P(3HB-co-3HV) after additiong of precursors sodium propionate and valeric acid. For both bacterial strains was the most useful model hydrolysates, which contains the biggest part of glucose. Morever, bacterial cells containing PHA granules were observed by fluorescence and transmission electron microscopy.
|
|
|
Polyhydroxyalkanoáty jako metabolity prokaryot adaptovaných na extrémní prostředí
Vodička, Juraj ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem této práce je studium polyhydroxyalkanoátů jako zásobních bakteriálních zdrojů uhlíku a energie produkovaných intracelulárně. Teoretická část práce je zaměřena na vlastnosti PHA, jejich biotechnologickou produkci a degradaci. Experimentální část bakalářské práce se zabývá produkcí polyhydroxyalkanoátů pomocí halofilní bakterie Halomonas organivorans využitím různých uhlíkatých substrátů. V úvodu byl úspěšně amplifikován a detekován gen phaC kódující PHA-syntázu. Potvrzena byla také extracelulární lipolytická aktivita zkoumaného kmene. Nejvhodnějšími substráty pro růst a produkci PHB byly shledány sacharidy, konkrétně nejlepší výsledky prokázala galaktóza a manóza. Z toho důvodu je velice vhodné využití kávové sedliny pro biotechnologickou produkci PHB, jako odpadu bohatého na galaktomanany. Na druhé straně byl zaznamenán velmi omezený nebo žádný růst na laktóze a xylóze, a z toho důvodu jsou odpadní syrovátka a lignocelulózové materiály bohaté na pentózy nevhodnými substráty pro požadovaný účel. Naopak se objevuje potenciální využití odpadní melasy kvůli dobrým výsledkům ultivace na sacharóze. Pomalý růst a snížená produkce byly zjištěny při kultivaci bakterií na kuchyňském odpadu a odpadním glycerolu. Koncentrace soli vhodná pro růst H. organivorans a produkci PHB byla optimalizovaná na hodnotu 60 g/l. Přídavek vybraných prekurzorů 3-hydroxyvalerátu po 24 hodinách kultivace nepomohl k tvorbě kopolymeru P(3HB-co-3HV). Sice tento přídavek zpomalil růst, ale zvýšil procentuální tvorbu PHB v buňkách. Obecně byly výtěžky biotechnologické produkce PHB vysoké, téměř ve všech úspěšných případech byl procentuální obsah PHB v buňkách větší než 50 %. S ohledem na výsledky lze konstatovat, že k úplnému zhodnocení H. organivorans jako potenciálního biotechnologického producenta jsou žádoucí další experimenty.
|
|
|
Stresová odolnost bakteriálních monokultur a směsných kultur
Chorvátová, Michaela ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
V tejto bakalárskej práci bola skúmaná stresová odolnosť bakteriálnych monokultúr a definovanej zmiešanej kultúry. Teoretickú časť predstavuje literárna rešerš, ktorá sa zaoberá všeobecnou stresovou odolnosťou baktérií a dynamikou ich rastu. Ďalej sú predstavené polyhydroxyalkanoáty, ich zapojenie do stresovej odpovede baktérií a významná moderná metóda akou je prietoková cytometria, ktorá predstavovala dôležitú súčasť experimentu. V experimentálnej časti bola študovaná odolnosť voči osmotickému a teplotnému stresu. Pre tento účel boli použité monokultúry PHA akumulujúceho kmeňa Cupriavidus necator H16 a mutantného kmeňa Cupriavidus necator H16/PHB-4 neschopného akumulácie PHA. Definovaná zmiešaná kultúra bola pripravená kokultiváciou týchto dvoch kmeňov. Celkovo možno konštatovať, že akumulácia a utilizácia PHA, konkrétne poly(3-hydroxybutyrátu), zvýšila odolnosť baktérií, čo sa najviac prejavilo u osmotického stresu, kedy koncentrácie soli nespôsobili výraznejšie zníženie viability u Cupriavidus necator H16 oproti mutantnému kmeňu, ktorého viabilita klesala s rastúcou intenzitou stresu. Experimentálne teploty naopak nepredstavovali výrazný vplyv na viabilitu buniek, pričom sa takmer vždy potvrdilo, že baktériám sa najviac darilo pri ich teplotnom optime 30 °C.
|
|
|
Využití fyzikálně-chemických analýz při studiu stresových odpovědí mikroorganismů
Slaninová, Eva ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá využitelností fyzikálně-chemických analýz při vlivu stresových faktorů na mikroorganismy, kde hlavní náplní této práce bylo navržení a následná optimalizace technik a metod, které jsou obecně využívány v odlišných oblastech vědy a výzkumu. Jako modelové mikroorganismy, podrobené fyzikálně-chemickým analýzám v experimentální části této práce, byly zvoleny dva bakteriální kmeny: Cupriavidus necator H16 a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 lišící se schopností produkce polyhydroxyalkanoátů. Nejprve byly navrženy a otestovány mikroskopické techniky jako transmisní elektronová mikroskopie (TEM), kryo skenovací elektronová mikroskopie (kryo-SEM) a mikroskopie atomárních sil (AFM) sloužící k charakterizaci morfologických odlišností bakterií. Dále byly stanovovány a porovnávány viskoelastické vlastnosti bakterií prostřednictvím oscilačních testů metodou reologie, které byly rovněž otestovány a optimalizovány s ohledem na typ vzorků. Mezi další navržené a otestované fyzikálně-chemické metody patří termická analýza, konkrétně diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) a termogravimetrická analýza (TGA) zabývající se transportem vody a chování intracelulární vody s ohledem na vliv přítomných PHB granulí v bakteriích. Poslední technika, která byla zavedena a optimalizována, je použití dynamického a elektroforetického rozptylu při měnícím se pH, sloužící k charakterizaci povrchových vlastností bakterií (velikost, zeta potenciál, izoelektrický bod).
|
|
|
Studium struktury a vlastností vody v blízkosti hydrofilních povrchů
Slaninová, Eva ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce je zaměřena na studium vlivu hydrofilních povrchů na strukturu a vlastnosti vody. Zejména se zaměřuje na nové experimentální poznatky ohledně anomálií chování vody v blízkosti hydrofilních povrchů, kde dochází k tvorbě tzv. exkluzních zón. Exkluzní zóny byly studovány za pouţití modelové hydrofilní vrstvy (Nafion), a to z hlediska rychlosti jejich vzniku, vlivu přídavku iontů a polárních látek a studia struktury vody v hydratované hydrofilní membráně pomocí infračervené spektroskopie.
|
host ::
RSS.