|
|
Mechanismy přenosu signálu muskarinovými receptory
Dolejší, Eva ; Doležal, Vladimír (vedoucí práce) ; Kršiak, Miloslav (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
Muskarinové acetylcholinové receptory (mAChR) patří do rodiny receptorů spřažených s G-proteiny. Existují v pěti podtypech označovaných jako M1 až M5, které se v různém podtypovém zastoupení nacházejí jak v centrálním nervovém systému, tak na periferii. Muskarinové receptory hrají důležitou roli v mnoha specifických fyziologických funkcích. Narušení přenosu přes mAChR se vyskytuje u závažných onemocnění jako jsou Alzheimerova choroba, schizofrenie či Parkinsonova choroba. Provází je úpadek kognitivních funkcí, který významně souvisí s narušením aktivace M1 receptorů v mozku. Vysoký stupeň homologie ortosterického vazebného místa mAChR velice ztěžuje vývoj podtypově selektivních agonistů. Jedním z mála známých je xanomelin, který účinně aktivuje zejména M1 a M4 podtypy. Xanomelin interaguje s mAChR unikátním způsobem, neboť je kromě reverzibilní vazby do ortosterického místa schopen se na receptor vázat neodmyvatelnou vazbou a alostericky ovlivňovat funkci receptoru. Zatím nevíme, co je podstatou funkční selektivity xanomelinu. Ve snaze o objasnění těchto mechanismů jsme studovali okamžité a dlouhodobé účinky xanomelinu na aktivaci muskarinových receptorů. Použili jsme fibroblasty z vaječníků čínského křečka exprimující jednotlivé podtypy mAChR. Buňky obsahující M2 a M4 receptory jsme přechodně...
|
|
|
Úloha variabilních řetězců na rozhraní podjednotek ve formování ATP-vazebné kapsy a funkci P2X4 receptoru
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
5 ABSTRAKT Krystalizace P2X4 receptoru (P2X4R) ze zebřičky ("zebra fish", zfP2X4) v uzavřeném a otevřeném stavu odhalila změny v konformacích ektodomény včetně změn v oblasti styčných ploch mezi levou ("left flipper"; LF) a hřbetní ("dorsal fin"; DF) ploutví. Roli těchto struktur ve formování ATP vazebné kapsy a funkci receptoru jsme zkoumali pomocí alaninové skenovací mutageneze úseků LF (D280-N293) a DF (R203-L214) potkaního P2X4R, a s využitím ATP a analogických agonistů 2-(methylthio)adenosin 5'- trifosfátu, adenosin 5'-(γ-thio)trifosfátu, 2'(3'-O-(4-benzoylbenzoyl)adenosin 5'- trifosfátu a α,β-methylenadenosin 5'-trifosfátu. Sníženou citlivost anebo účinnost ATP mělo 15 z 26 vytvořených mutací. Mutace R203A, N204A a N293A byly v podstatě nefunkční, ale jejich funkci bylo možné obnovit ivermektinem, alosterickým modulátorem P2X4R. Mutace I205A, T210A, L214A, P290A, G291A a Y292A měly změněnou odpověď na ATP a na analogické agonisty. Naproti tomu mutace L206A, N208A, D280A, T281A, R282A a H286A nevykazovaly ve srovnání s divokým typem receptoru žádnou změnu v odpovědích na ortosterické agonisty. Tyto pokusy, společně s homologním modelováním ukázaly, že aminokyseliny z první skupiny nacházející se v horní části obou řetězců LF a DF, se podílejí na přesné organizaci ATP-vazebné kapsy a iniciaci převodu...
|
|
|
Funkční úloha cytoplazmatických konců ankyrinového receptoru TRPA1
Vašková, Jana ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
Receptor TRPA1 je převážně exprimován na primárních aferentních senzorických neuronech, kde může být aktivován širokým spektrem štiplavých a reaktivních sloučenin, jakými jsou například allyl isothiokyanát nebo cinnamaldehyd. Tyto látky aktivují TRPA1 prostřednictvím kovalentní modifikace cysteinů z cytoplazmatické strany, odkud může být kanál zároveň modulován vnitrobuněčnými vápenatými ionty. Významnou roli v těchto procesech hrají aminové (N-) a karboxylové (C-) konce receptoru. Předkládaná diplomová práce přináší nové poznatky o úloze specifických cytoplazmatických domén v aktivaci TRPA1 receptoru, jež byla studována pomocí elektrofyziologických a molekulárně biologických metod. Měřením membránových proudů TRPA1, vyvolaných chemicky, napětím a vápenatými ionty, byla nalezena vysoce konzervovaná serinová a threoninová rezidua v rámci N-koncové ankyrinové domény, jejichž mutacemi byly silně ovlivněny odpovědi kanálu. Zároveň bylo nově zjištěno, že distální karboxylový konec, o němž bylo již dříve známo, že se podílí na regulaci receptoru vápenatými ionty, přispívá k napěťově závislé aktivaci TRPA1 receptoru.
|
|
| |
|
|
Molekulární mechanizmy aktivace a modulace TRPV3 receptoru
Chvojka, Štěpán ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent)
TRPV3 receptor je teplotně citlivý iontový kanál patřící do rodiny TRP (transient receptor potential) vaniloidních receptorů. Tento kanál je exprimován v keratinocytech kůže, kde se společně s receptorem pro epidermální růstový faktor (EGFR) podílí na růstu a morfogenezi chlupů, tvorbě kožní bariéry, detekci teplotních změn, vzniku bolesti a pruritu. TRPV3 je aktivován řadou rostlinných produktů, jako je karvakrol z oregána, tymol z tymiánu nebo eugenol z hřebíčku. Jeho unikátní vlastností je senzitizace, postupné zvyšování proudové odpovědi při opakované aplikaci agonisty, molekulární podstata tohoto děje však není dosud objasněna. Jednou ze zvažovaných možností je přímá fosforylace TRPV3 proteinu prostřednictvím signální dráhy zahrnující EGFR a mitogenem aktivovanou protein kinázu MAPK1/MAPK3 (také zvanou ERK2/ERK1). V předložené diplomové práci jsme pomocí elektrofyziologické techniky patch-clamp zjišťovali, zda senzitizace TRPV3 receptoru exprimovaného v buněčné linii lidských imortalizovaných keratinocytů může být ovlivněna mutacemi na predikovaných konsensuálních místech pro fosforylaci MAPK1/MAPK3. Z osmi testovaných mutantů, ve kterých byl zaměněn treonin nebo serin za kyselinu asparagovou mimikující fosforylaci, jsme určili 6 míst, jejichž mutace ovlivnila alespoň jeden z testovaných...
|
|
|
Modulační mechanizmy nociceptivních TRP kanálů
Maršáková, Lenka ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Detekce bolestivých podnětů na periferii a jejich transdukce do CNS je zprostředkována některými zástupci teplotně citlivých transient receptor potential (TRP) kanálů, kteří se exprimují na volných zakončeních primárních aferentních senzorických neuronů nazývaných nociceptory. Prostřednictvím TRP kanálů nociceptory vnímají nejen teplotní stimuly, ale také podněty mechanické a chemické. Ze sedmi v současnosti identifikovaných teplotně citlivých TRP kanálů jsou za detekci bolestivých teplotních podnětů zodpovědní dva teplem aktivovaní zástupci vaniloidních receptorů: TRPV1 (≥ 42 řC), TRPV2 (≥ 52 řC) a jeden chladem aktivovaný zástupce ankyrinových receptorů TRPA1 (≤ 17 řC). Tyto kanály jsou typické složitým a dosud neznámým mechanizmem působení, jejichž poznání je nezbytné k pochopení jejich komplexních funkcí v organizmu a následně pro navrhování potenciálních analgetik. Nové poznatky, které jsou náplní této studie, směřují k objasnění mechanizmů působení dvou výše zmíněných nociceptivních receptorů TRPV1 a TRPA1, se zaměřením na kafrovou a napěťovou citlivost TRPV1 a vápníkovou modulaci TRPA1 receptoru. Prvním tématem, které je v této práci diskutováno, je modulační mechanizmus kafru na TRPV1 receptor. Kafr je účinnou, v přírodě se vyskytující látkou používanou díky svým analgetickým účinkům od nepaměti....
|
|
|
Struktura a funkce rekombinantního P2X4 receptoru
Rokič, Miloš ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Vlachová, Viktorie (oponent) ; Bendová, Zdeňka (oponent)
5 Abstrakt Purinergní P2X receptory jsou membránové iontové kanály aktivované extracelulárním ATP. U savců bylo dosud nalezeno sedm různých podtypů, označovaných jako P2X1-7, které svojí stavbou představují rodinu ligandem řízených iontových kanálů s výjimečnými strukturně/funkčními vlastnostmi. Každý P2X receptor je tvořen třemi podjednotkami, kde každá podjednotka má dvě transmembránové domény. Krystalografická data ukazují, že pór iontového kanálu se nachází mezi druhými transmembránovými doménami. Krystalová struktura P2X4 receptoru zebřičky (Danio rerio) je dostupná pro receptor v uzavřeném a otevřeném stavu s navázanou molekulou ATP, a proto je přesná struktura vazebného místa pro ATP vyřešena. Cílem této dizertační práce bylo studium strukturně-funkčních vlastností v modelu rekombinantního P2X4 receptoru. Technikou bodové mutageneze a elektrofyziologickou technikou patch clamp byl zkoumán funkční význam pěti konzervovaných cysteinových párů v ektodoméně a funkční úloha aminokyselinových zbytků, které tvoří extracelulární vestibul P2X4 iontového kanálu potkana. Všech deset cysteinů, jeden po druhém, bylo nahrazeno alaniny nebo threoniny a ATP-stimulované proudy byly snímány z HEK293T buněk nesoucích divoký typ P2X4 receptoru nebo jeho mutace. Výsledky získané u mutací C116A, C126A, C149A a C165A...
|
|
|
Mechanizmy aktivace a modulace vaniloidních TRP receptorů
Boukalová, Štěpána ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hock, Miroslav (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Štěpána Boukalová Mechanizmy aktivace a modulace vaniloidních TRP receptorů TRPV1 a TRPV3 receptory jsou teplocitlivé iontové kanály patřící do rodiny vaniloidních TRP receptorů. TRPV1 receptor, jenž je specificky exprimován v nociceptivních neuronech, představuje klíčovou molekulu v transdukční dráze bolestivých podnětů, včetně nociceptivního tepla. Význam TRPV3 receptorů ve vnímání tepelných podnětů je prozatím sporný, dobře prokázaná je však jeho úloha v regulaci proliferace a diferenciace keratinocytů. TRP receptory, podobně jako napěťově ovládané draslíkové kanály (Kv), jsou tvořeny čtyřmi podjednotkami, jež každá obsahuje šest transmembránových segmentů (S1-S6). V první části své dizertační práce jsem se zaměřila na úlohu S1 transmembránové oblasti ve funkčních vlastnostech TRPV1 receptoru. Z našich výsledků vyplývá, že část S1 směřující do extracelulárního prostředí hraje významnou úlohu ve vrátkování iontového kanálu. Konzervativní mutace kladně nabitého rezidua v dané oblasti (R455K mutace) vedla ke vzniku TRPV1 iontových kanálů se zvýšenou aktivitou, jež však nebyly citlivé ke stimulačnímu působení sníženého pH prostředí. Naopak, zvýšená koncentrace protonů v extracelulárním prostředí vedla ke stabilizaci zavřeného stavu mutantního iontového kanálu. Velmi podobné fenotypické vlastnosti jako u...
|
|
|
Expression and functional characteriz ation of transient receptor potential vanilloid - related channel 4 (TRPV4) in hippocampal astrocytes after ischemia /reperfusion
Butenko, Olena ; Anděrová, Miroslava (vedoucí práce) ; Bojar, Martin (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
Vaniloidní receptor podtypu 4 (TRPV4 - z anglického transient receptor potential), který patří do skupiny TRP kanálů, je pro vápník propustný kationtový kanál. TRPV4 je aktivován osmoticky, teplotně, nízkým pH i řadou extracelulárních a intracelulárních chemických ligandů a druhých poslů a z tohoto důvodu mohou hrát významnou úlohu v patofyziologii neuronů a gliových buněk. V této studii jsme zkoumali vliv mozkové hypoxie/ischémie (H/I) na funkční expresi TRPV4 kanálů u astrocytů v CA1 oblasti hipokampu dospělého potkana. Ischemické poškození hipokampu bylo vyvoláno bilaterální 15-ti minutovou okluzí karotid v kombinaci s hypoxií. Imunohistochemické analýzy ukázaly, že 7 dní po H/I, exprese TRPV4 je výrazně zvýšena u astrocytů v CA1 oblasti hipokampu, a že toto zvýšení exprese TRPV4 koreluje s vývojem astrogliózy. Hipokampální astrocyty v tkáňových řezech nebo astrocyty izolované z CA1 oblasti hipokampu odpovídají na aplikaci TRPV4 aktivátoru 4-alpha-forbol- 12-13-didecanoate (4αPDD) zvýšením intracelulárního vápníku [Ca2+ ]i a aktivací kationtového proudu. Zvýšení [Ca2+ ]i i TRPV4-specifický proud jsou výrazně sníženy odstraněním extracelulárního vápníku nebo aplikací ruthenium red nebo RN1734, které patří k antagonistům TRP kanálů. V průběhu reperfúze po H/I poškození, TRPV4-specifické odpovědi...
|
|
|
Teplotně aktivované TRP iontové kanély v nociceptivních neuronech
Chvojka, Štěpán ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Mrózková, Petra (oponent)
Transdukční iontové kanály zajišťují převod vnějších podnětů různých modalit na elektrickou aktivitu senzorických neuronů. Prostřednictvím těchto specializovaných proteinů je organizmus informován o aktuálním stavu okolního prostředí a může tak reagovat na potenciální nebezpečí, které ohrožuje jeho integritu. Mimořádně důležitou úlohu v transdukci tepelných podnětů zajišťují iontové kanály skupiny TRP (transient receptor potential) receptorů, jejichž molekulární struktura byla v posledních patnácti letech identifikována a na něž se soustředila pozornost zejména v souvislosti se studiem mechanizmů bolesti. Molekulárně biologické techniky umožnily studovat funkci těchto iontových kanálů ve vztahu k jejich struktuře, objasnit jejich fyziologickou úlohu a zjišťovat možnosti jejich farmakologického ovlivnění. Cílem práce je formou literární rešerše zpracovat souhrnný přehled současných poznatků o funkčních vlastnostech a možné fyziologické úloze specifické podskupiny savčích TRP iontových kanálů, které jsou specificky aktivovány teplotními podněty: teplem a chladem.
|
host ::
RSS.