|
| |
|
|
A transcriptomic-based comparison of barley cultivars differing with respect to their low temperature acclimation capacity
Janská, Anna ; Ovesná, Jaroslava (vedoucí práce) ; Vaňková, Radomíra (oponent) ; Honys, David (oponent)
V disertační práci se zabývám porovnáním transkriptomických profilů odrůd ječmene (Hordeum vulgare L.) s odlišnou schopností chladové aklimatizace, a to na úrovni listu a odnožovacího uzle (OU). Odnožovací uzel jsem zvolila proto, že pro přezimování ozimých obilovin je to zásadní orgán. Abych pokryla první i druhou fázi aklimatizace, zvolila jsem tři týdny otužování při +3řC následované jedním dnem při -3řC. Mrazové poškození jsem měřila metodou konduktometrie (Publikace 2 a 3) s použitím optimalizovaného protokolu, který popsal Prášil a Zámečník (1998). Stejný protokol byl přizpůsoben pro sledování přírůstku mrazem poškozených rostlin (Publikace 2); pro tento účel byly testované rostliny po mrazovém cyklu zasazeny, seříznuty nad OU a byl sledován přírůstek a míra přežití během dalšího týdne. Pro transkriptomické analýzy jsem zvolila platformu DNA čipů Affymetrix (Close et al. 2004) a pro jejich následnou analýzu programy R, MAS 5.0 (Ihaka a Gentleman 1996, Publikace 2 i 3), Gene Spring GX 7.3 (Agilent Technologies, Santa Clara CA; Publikace 2) a MapMan (http://mapman.gabipd.org; Thimm et al. 2004; Usadel et al. 2005; Publikace 2), "Self- Organizing Maps" algoritmus (Kohonen et al. 1996; Publikace 3), MIPS FunCat (Ruepp et al. 2004; http://mips.gsf.de/projects/funcat; Publikace 2). První část...
|
|
|
Na velikosti záleží - biogeneze a funkce siRNA u Arabidopsis
Přibylová, Adéla ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
RNA interference (RNAi) hraje důležitou roli v různých biologických procesech zahrnujících regulaci genů a transposonů, vývoje částí rostlinného těla, reakci na stres, remodelaci chromatinu a antivirovou obranu. Základem RNAi jsou krátké molekuly RNA (malé RNA, sRNA), které rostliny produkují ve velikostním rozmezí 21 - 24 nukleotidů (nt) a které jsou schopny na základě komplementarity rozpoznat cílové molekuly RNAi. Malé RNA lze rozdělit na dva základní typy: microRNA (miRNA) a malé interferující RNA (siRNA). K tvorbě a aktivitě malých RNA jsou potřeba proteiny z několika genových rodin: DICER-LIKE (DCL) vytváří malé RNA z dvouvláknového RNA prekurzoru, který je často tvořen aktivitou RNA dependentní RNA polymerázy (RDR). Proteiny ARGONAUTE (AGO) s těmito malými RNA asociují a vytváří tak RNA-indukovaný umlčující komplex (RISC), který hraje klíčovou roli v rozpoznání cílové molekuly a ve výkonné fázi RNAi. Na to, jakou dráhou se bude RISC komplex ubírat, má vliv velikost, struktura i biogeneze malé RNA. RNAi působí jednak na post-transkripční úrovni (PTGS), formou degradace cílové RNA či blokováním translace, a jednak na transkripční úrovni (TGS), kde sRNA zprostředkovávají metylaci histonů a DNA.
|
|
|
Umlčování exprese transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Tyč, Dimitrij ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
Náhodný objev RNA interference před pár desítkami let u rostlin a její následné popsání Firem et al. v roce 1998 znamenal doslova revoluci v molekulární biologii a řadě dalších oborů. Výzkumníci odkryli rozsáhlý a nečekaný mechanizmus regulace genové exprese na mnoha úrovních u téměř všech studovaných eukaryot. Prvotní studie u rostlin odhalily umlčování exprese z vnějšku dodaných genů i příslušných endogenů. Brzy bylo tedy jasné, že tento proces neslouží organizmům pouze v obraně před viry, ale i před mobilními genetickými elementy a k regulaci vlastních genů. Společným jmenovatelem všech mechanizmů RNAi je dvouvláknová RNA, která je štěpena na malé RNA. Ty pak řídí v součinnosti s řadou dalších proteinů buď štěpení částečně či plně komplementární mRNA či blokují její translaci v procesu posttranskripčního umlčování (PTGS), nebo se v procesu RNA řízené metylace DNA (RdDM) podílejí na umlčování genů na transkripční úrovni doprovázené remodelací chromatinu. Mechanizmy RNAi se uplatňují i při transformaci rostlin, kdy způsobují v odvozených liniích značnou variabilitu a nestabilitu v expresi vnesených genů. Řada biotechnologických postupů ovšem vyžaduje dlouhodobou definovanou a stabilní expresi transgenu, kterou právě RNAi znesnadňuje. Hlavním cílem diplomové práce bylo posoudit vliv vybraných...
|
|
|
Funkční analýza podjednotek rostlinného Arp2/3 komplexu
Kukla, Jakub ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
1. Abstrakt ARP2/3 komplex je velmi dobře prostudovaný v případě živočichů, hraje klíčové úlohy v motilitě buněk a nitrobuněčných organel. Jeho defekty jsou spojeny s těžkými růstovými poruchami a letalitou u postižených buněk. Naproti tomu u rostlin nebyl zjištěn tak dramatický fenotyp mutací v ARP2/3 komplexu jako u živočichů. Je možné, že právě rozdílný způsob života rostlin a živočichů, přispívá k odlišným strategiím využití buněčného cytoskeletu, jehož je ARP2/3 komplex součástí. Tento vysoce konzervovaný komplex 7 proteinů je od kvasinek až po člověka využíván především k tvorbě aktinových vláken de novo, jeho pomocí vznikají složité aktinové sítě a někteří parazité jsou schopny jeho nukleační schopnosti, spojené s aktinem, zneužívat k aktivnímu pohybu uvnitř hostitelské buňky. Jelikož rostliny obklopuje buněčná stěna,bránící tak jejich aktivnímu pohybu, zároveň poskytující buňkám oporu a udělující tvar, bylo by nasnadě přemýšlet o tom, zda by ARP2/3 komplex v rostlinách mohl zastupovat i jiné funkce, které u živočichů neznáme. Pokud uvažujeme o odlišné životní strategii rostlin a živočichů, nemůžeme přehlédnout i to co obě říše spojuje. Tedy potřeba udržování integrity vezikulárního transportu a endomembránových procesů. Bez aktinové a tubulinové sítě by tyto procesy nemohly probíhat. Ovšem vzhledem...
|
|
|
Revealing phosphoproteins playing role in tobacco pollen activated in vitro
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
6 Abstract in Czech Po dopadu na bliznu se zralý pyl tabáku rehydratuje, aktivuje a klíčí z něj pylová láčka. Rehydratace je doprovázena de-represí skladovaných mRNA, z nichž se syntetizují nové proteiny. Při vývoji zralého pylu v rychle rostoucí pylovou láčku se velmi pravděpodobně uplatňují také posttranslační modifikace proteinů, konkrétně fosforylace, jež se podílí na regulaci celé řady buněčných procesů. Vzhledem k tomu, že pouze malý podíl proteinů je v daném okamžiku v buňce fosforylován, bývá nevyhnutelné využít nejrůznější obohacovací techniky. Pro obohacení fosfoproteinů z celkového proteinového extraktu zralého pylu a pylu aktivovaného in vitro 30 minut byla v této diplomové práci aplikována afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu (MOAC), kde byl matricí hydroxid hlinitý. Získaná obohacená frakce byla rozdělena nezávisle dvěma metodami; klasickou dvojrozměrnou elektroforézou (2D-GE) a kapalinovou chromatografií (LC). Hmotnostní spektrometrií (MS) byly analyzovány vzorky získané oběma způsoby dělení, a celkem tak bylo identifikováno 139 fosfoproteinových kandidátů. Fosfopeptidové obohacení využívající oxid titaničitý vedlo k lokalizaci 51 fosforylačních míst, a tak rozšířilo počet přesně identifikovaných fosforylačních míst na celkových 52. Klíčová slova: samčí gametofyt, zralý...
|
|
|
Obohacovací techniky užívané ve fosfoproteomice
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Zdráhal, Zbyněk (oponent)
Reverzibilní fosforylace proteinů patří mezi nejdynamičtější posttranslační modifikace. Fosforylace hraje důležitou roli v mnoha buněčných procesech, jmenujme např. buněčné dělení, přenos signálu, dynamiku cytoskeletu, regulaci translace, cílení proteinů a metabolizmus. Bohužel, množství fosfoproteinů v buňce často neodpovídá jejich významu, a tak pro jejich detekci bývá nevyhnutelné využít obohacovacích technik. K obohacení může dojít buď ve formě fosfoproteinů, nebo fosfopeptidů, popř. může být zvolena kombinace obou přístupů. Většina obohacovacích strategií je založena na chemické modifikaci fosfátů, afinitě fosfátu ke kladně nabité chromatografické matrici a na použití protilátek. Jednotlivé metody mají své výhody i nevýhody. Navíc kompletnějšího a spolehlivějšího odhalení fosfoproteomu lze obvykle dosáhnout až kombinací několika metod. V posledních pěti letech byly mnohé protokoly vylepšeny a další se nově objevily. Tato bakalářská práce shrnuje současné znalosti o obohacovacích metodách užívaných ve fosfoproteomice. Klíčová slova: fosfoproteomika, obohacování fosfoproteinů, obohacování fosfopeptidů, IMAC, MOAC, oxid titaničitý TiO2, hydroxid hlinitý Al(OH)3, protilátky
|
|
|
Identification and characterization of transcription facotrs affecting late stages of male gametophyte development in Arabidopsis thaliana
Dupľáková, Nikoleta ; Honys, David (vedoucí práce) ; Bříza, Jindřich (oponent) ; Fajkus, Jiří (oponent)
Záver Moja dizertačná práca bola venovaná zvýšeniu poznatkov o fungovaní komplexnej regulačnej siete transkripčných faktorov v samčom gametofyte Arabidopsis thaliana. Transkripčné faktory sú riadiacou jednotkou mnohých významných zmien nielen v rastlinnom organizme a sú zodpovedné za ich správny časový a priestorový priebeh. Ich odhalenie vrátane ich podrobnej funkčnej charakterizácie je dôležitou súčasťou nášho poznania. Okrem vyššie spomenutej snahy, ďalšou úlohou dizertačnej práce bolo vytvorenie inovatívneho konceptu prezentácie a hodnotenia dostupných expresných dát pochádzajúcich z DNA microarray čipov a prevedenie tohto prístupu do praxe vo forme on-line databázy a hodnotiacich nástrojov pre tieto expresné dáta. Výsledky mojej dizertačnej práce je možné zhrnúť do následujúcich bodov: 1. Bola vytvorená on-line sprístupnená databáza nazvaná Arabidopsis Gene Family Profiler (arabidopsisGFP, http://agfp.ueb.cas.cz/). Táto databáza vznikla za účelom poskytnutia nového nástroja pre prezentáciu transkriptomických dát, ktorý umožní užívateľovi rýchly a intuitívny spôsob ich zobrazenia pomocou virtuálnej rastliny. Virtuálna rastlina využíva inovatívny koncept "od jednoduchému k zložitému", ale zároveň ponúka užívateľovi aj tradičné možnosti zobrazenia expresných dát. Naša databáza može slúžiť ako referenčná...
|
|
|
Isoflavonsynthasa: přítomnost a aktivita v bobovitých a nebobovitých rostlinách
Pičmanová, Martina ; Honys, David (vedoucí práce) ; Vaňková, Radomíra (oponent)
Isoflavonsynthasa (IFS; CYP93C) hraje klíčovou roli v biosyntéze rostlinných sekundárních metabolitů - isoflavonoidů. Tyto fenolické látky, známé díky širokému spektru svých biologických účinků, jsou produkovány především rostlinami z čeledi bobovitých (Fabaceae). Ačkoliv bylo nejméně 225 isoflavonoidů popsáno i v 59 dalších čeledích, ortolog známých IFS z bobovitých rostlin byl doposud popsán pouze v jediné nebobovité rostlině - Beta vulgaris (čeleď Chenopodiaceae). Tato diplomová práce si na základě zmíněných poznatků kladla za cíl (1) identifikovat ortologní geny pro isoflavonsynthasu ve vybraných bobovitých a nebobovitých rostlinách a (2) vytvořit sytém pro ověřování správné funkce těchto genů. Naše metodika pro identifikaci ortologů IFS se osvědčila v případě dvou zkoumaných bobovitých rostlin - Phaseolus vulgaris L. a Pachyrhizus tuberosus (Lam.) Spreng, v jejichž genomické DNA byly nově identifikovány kompletní sekvence genu pro IFS. Aby bylo možno v budoucnu ověřit správnou funkci těchto a dalších případných genů pro IFS, byla provedena pilotní studie s IFS isolované z Pisum sativum L. (CYP93C18; GenBank number AF532999). Gen pro CYP93C18 byl identifikován, klonován s využitím Gateway™ technologie a vnesen do Arabidopsis thaliana - rostliny postrádající biosyntetickou dráhu isoflavonoidů....
|
|
| |
host ::
RSS.