|
|
Molekulárně-dynamické simulace komplexů sestávajících z nukleových kyselin a proteinů
Hammer, Jiří ; Barvík, Ivan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo studium interakcí proteinu Argonautu (Ago) s komplexy nukleových kyselin. Na základě krystalových struktur Argonautu (A. aeolicus, Aa-Ago) a popř. jeho domén (lidská PAZ doména, Hs-PAZ) bylo vyprodukováno dvanáct různých simulací. Prvé dvě využily modelu Aa-Ago s různými substráty: buď s DNA/RNA nebo RNA/RNA duplexem. Hlavní rozdíl byl pozorován při interakci PAZ domény (resp. jejích argininových reziduí), která tolerovala guide DNA, nikoli však guide RNA vlákno. To naznačuje možnou funkci PAZ domény při rozpoznávání duplexů RNA/RNA od hybridních duplexů DNA/RNA. V dalších simulacích (3-9) byla využita Hs-PAZ doména. Žádné konflikty s guide DNA vláknem nebyly pozorovány. Byla vyzkoušena různá uspořádání aktivního místa, počet iontů a jejich parametrizace. DD-katalytický motiv s D683 (ekviv. lidskému H807 z Ago2) koordinoval (jeden, popř. dva) ionty Mg2+. Vysoce konzervovaná rezidua R570 a E578 stabilizovala aktivní místo vzájemnou vodíkovou vazbou. Z hlediska nevratnosti procesu přeštípnutí mRNA může hrát důležitou úlohu první (nepárový) nukleotid z 5'-konce guide DNA. Tato úloha by spočívala v tvorbě vodíkového můstku s přeštípnutým vláknem mRNA vedoucí k jeho destabilizaci. Simulace (10-12) s homologními modely lidských Ago2 se ukázaly jako málo stabilní a věrohodné...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Inhibice Thymidin fosforylasy
Zákoucká, Eva ; Brynda, Jiří (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
1. Abstrakt Thymidin fosforylasa, také známá jako gliostatin nebo endotheliální růstový faktor odvozený z krevních destiček, je důležitý enzym metabolismu nukleosidů podílející se na degradaci a recyklaci DNA. Tento enzym katalyzuje reverzibilní fosforolýzu pyrimidin-2'- deoxynukleosidů na 2-deoxy-D-ribosa-1-fosfát a příslušnou nukleovou bázi a zároveň také katalyzuje přenos deoxyribosylů z pyrimidinových deoxynukleosidů k jiným nukleovým bazím za vzniku nového deoxynukleosidu a uvolnění báze z původního deoxynukleosidu. Thymidin fosforylasa je velmi zajímavým potenciálním terapeutickým cílem, jelikož se účastní se angiogenese, tedy tvorby nových cév, a to obzvláště v pevných nádorech mnoha různých tkání. Napomáhá tím výživě a růstu nádorů stejně jako vzniku metastází, tedy nových ložisek nádorů. Dále také inhibuje apoptózu, tedy řízenou smrt buňky, zejména nádorových buněk a degraduje některá protivirová a protinádorová léčiva. Kromě nádorových onemocnění je thymidin fosforylasa nadměrně produkována u dalších závažných onemocnění charakteristických tvorbou nových cév, jakými jsou například psoriáza, revmatoidní artritida nebo ateroskleróza. Omezení aktivity thymidin fosforylasy zejména selektivně v tkáních postižených uvedenými onemocněními by tedy mělo velmi rozsáhlý terapeutický význam. Proto byla na...
|
|
|
Studium strukturních rozdílů mezi izoformami 14-3-3 proteinů.
Macáková, Eva ; Gryčová, Lenka (oponent) ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce)
Proteiny 14-3-3 jsou regulační proteiny, které se vyskytují v mnoha isoformách ve všech eukaryotických organismech a účastní se řady buněčných dějů. V této práci jsem se zabývala vlivem struktury ohybu H8-H9 u ječmenných isoforem hv 14-3-3A a lidských isoforem 14-3-3ζ na afinitu k vazebnému partnerovi. Z dříve publikovaných výsledků vyplývá, že isoforma hv 14-3-3A se váže s nejmenší afinitou, což může být způsobeno přítomností glycinu v H8-H9 ohybu, na rozdíl od ostatních isoforem, které mají na stejné pozici serin. Vazebnou afinitu jsem zjišťovala jak pro původní protein hv 14-3-3A WT, tak i pro jeho mutant, u kterého byl glycin v H8-H9 ohybu nahrazen serinem. Pro srovnání jsem také provedla měření s lidskou isoformou 14-3-3ζ WT, která v H8-H9 ohybu na studované pozici obsahuje serin, a jejího mutantu, u kterého byl tento serin nahrazen glycinem. Proteiny jsem exprimovala v bakteriích E. coli kmen BL21(DE3) a poté jsem je purifikovala. Disociační konstanty pro vazbu peptidů pRaf značenými sondami FITC a ATTO jsem získala pomocí metod fluorescenční korelační spektroskopie a stacionárního měření intenzity fluorescence. Z naměřených hodnot vyplývá, že v případě lidských i ječmenných isoforem došlo po mutaci ke zhoršení afinty k vazebnému partnerovi.
|
|
|
Studium interakce C-konce DNA-vazebné domény FOXO4 s DNA
Zusková, Iva ; Teisinger, Jan (oponent) ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce)
Forkhead transkripční faktory jsou strukturně příbuzné molekuly obsahující přibližně 110 aminokyselin-velkou konzervovanou DNA-vazebnou doménu známou jako forkhead doména. Protein FOXO4 náleží do podskupiny "O" forkhead transkripčních faktorů. Zástupci podskupiny FOXO forkhead transkripčních faktorů se podílejí na mnoha důležitých biologických procesech. FOXO faktory se účastní kontroly metabolismu, buněčného cyklu, apoptózy a ochrany vůči oxidativnímu stresu. DNA-vazebná doména členů FOXO se skládá ze tří α-helixů (H1, H2 a H3), tří β-vláken (S1, S2 a S3) a dvou flexibilních ohybů (nazývaných jako křídla W1 a W2). Úloha ohybu W2 při vazbě FOXO na DNA je nejasná. Ohyb W2 pravděpodobně interaguje s oblastí DNA předcházející hlavní vazebný motiv FOXO faktorů. Spekuluje se, že vazebná afinita DNA-vazebné domény FOXO4 k DNA roste s obsahem A-T párů v oblasti DNA předcházející hlavní vazebný motiv. Pro ověření této hypotézy byla exprimována a purifikována DNA-vazebná doména FOXO4 a byla určena její vazebná afinita ke třem různým DNA duplexům lišících se obsahem A-T párů v oblasti před hlavní vazebnou sekvencí. Vazebná afinita byla určena pomocí měření změn stacionární anisotropie fluorescence. Toto stanovení neukázalo žádné signifikantní rozdíly mezi vazebnou afinitou DNA-vazebné domény FOXO4 k DNA o...
|
|
|
Exprese a purifikace kinasove domény ASK1 kinasy.
Bártová, Hana ; Gryčová, Lenka (oponent) ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce)
Cílem této diplomové práce bylo nalezení optimálních podmínek pro expresi ASK1 kinasy v prokaryotním expresním systému a vývoj purifikačního protokolu umožňujícího přípravu miligramových množství stabilního a rozpustného proteinu. Byly otestovány různé podmínky exprese v bakteriích E. coli s různou teplotou exprese, složením kultivačního média či momentu provedení indukce. Při přípravě purifikačního protokolu byly testovány různé metody purifikace proteinů. Finální protokol je založen na kombinaci chelatační chromatografie a následné gelové permeační chromatografie. Výsledkem diplomové práce je protokol umožňující přípravu 1 mg čisté kinasy ASK1 z 1 litru média.
|
|
| |
host ::
RSS.