|
|
Využití specifických inhibitorů karbonické anhydrázy IX pro fluorescenční značení rakovinných buněk
Pospíšilová, Klára ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Lidské karbonátlyázy jsou metaloenzymy, které se účastní mnoha fyziologických pochodů v organismu, ale hrají také roli v patogenezi řady chorob. Karbonátlyáza IX (CAIX) se, na rozdíl od ostatních 15 izoenzymů lidských karbonátlyáz, za normálních podmínek vyskytuje v organismu jen v omezené míře, avšak v hypoxických nádorech je vysoce exprimovaným znakem na povrchu buněk. Z tohoto důvodu je tento enzym dobrým cílem pro terapii a diagnostiku nádorů, a proto jsou proti CAIX vyvíjeny různé monoklonální protilátky i specifické inhibitory. V této práci byla ověřována možnost využít polymerní konjugát nesoucí specifický inhibitoru CAIX ke fluorescenčnímu značení rakovinných buněk. Prostřednictvím průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie byla testována specifická vazba polymerního konjugátu na různých buněčných liniích a schopnost vazby tohoto polymerního konjugátu byla srovnávána s CAIX specifickou monoklonální protilátkou M75 a jejím jednořetězcovým fragmentem scFv M75. Dále byly zjišťovány schopnosti testovaného konjugátu inhibovat enzymovou aktivitu CAIX. Pro tyto experimenty byl připraven a purifikován rekombinantní protein CAII, který byl dále též využit pro účely proteinové krystalizace. Testy inhibičních aktivit rovněž umožnily vytipovat nové inhibitory CAIX, které by mohly být díky lepším...
|
|
|
Structural studies of LEDGF/p75 interactions
Těšina, Petr ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Spiwok, Vojtěch (oponent)
4 ABSTRAKT Protein LEDGF/p75 je lidský transkripční koaktivátor, který je asociován s epigenetickými modifikacemi transkripčně aktivního chromatinu. Je také nezbytný v procesu integrace HIV do genomu hostitelské buňky a v leukemogenezi způsobené fúzními produkty genu kódujícího protein MLL1. Interakce proteinu LEDGF/p75 s HIV integrázou a komplexem MLL1-menin jsou považovány za potenciální cíl terapeutického zásahu. Interakce proteinu LEDGF/p75 s HIV integrázou i MLL1 jsou zprostředkovány tzv. integrázu vážící doménou (IBD - integrase binding domain). Zatímco patofyziologické interakce IBD LEDGF/p75 byly intenzivně studovány, těm fyziologickým byla věnována malá pozornost. Mimo HIV integrázy a MLL1 interaguje LEDGF/p75 skrze IBD také s proteiny JPO2, PogZ, ASK a MLL2. Jelikož se interakce IBD s HIV integrázou stala cílem pro vývoj inhibitorů, bylo nutné získat informace o ostatních interakcích této domény. Jen díky detailní charakterizaci všech interakcí IBD je možné zajistit specifické cílení vyvíjených inhibitorů. Proteinový komplex IBD-MLL1-menin byl již dříve strukturně charakterizován, ale pouze částečně. Pomocí NMR spektroskopie se nám podařilo zmapovat novou interakční oblast komplexu IBD-MLL1. Toto navazující interakční rozhraní je schopné zajistit interakci IBD s MLL1 i bez přítomnosti meninu,...
|
|
|
Strukturní biologie enzymů metabolizujících merkaptopurin
Soldánová, Anna ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Merkaptopurin (6-merkaptopurin) patří společně s příbuznými látkami azathioprinem a 6-thioguaninem mezi široce používaná chemoterapeutika a imunosupresiva. Během terapie thiopurinovými léčivy se mohou u pacientů objevit závažné nežádoucí účinky, jako například myelosuprese, nebo snížená terapeutická účinnost podávaného léčiva. Rozvoj metod sekvenace DNA a RNA umožnuje rozpoznat některé z příčin zmíněných problémů - různé genetické varianty enzymů účastnících se metabolismu fyziologických purinů a thiopurinových léčiv. Některé známé varianty těchto enzymů zásadním způsobem ovlivňují koncentraci cytotoxických forem thiopurinů, které mají dopad na úspěšnost a snášenlivost terapie. V současnosti je popsáno několik mutantních variant genů enzymů metabolizujících thiopurinové deriváty, ale molekulární mechanismy vlivu těchto mutací nejsou dosud dostatečně prostudovány. Znalost trojrozměrné struktury těchto enzymů může objasnit projevy dané genetické varianty na úrovni proteinu a její efekt na biologickou aktivitu thiopurinů. Tato práce se zaměřuje zejména na biochemicko-strukturní popis thiopurin-S-methyltransferasy, fosfatasy NUDT15 a cytosolické 5′-nukleotidasy II. Shrnuje problematiku s důrazem na význam strukturní biologie v interpretaci úlohy mutantních variant těchto enzymů v metabolismu thiopurinových léčiv.
|
|
|
Understanding the interaction of antibodies and transcription factors with their ligands through structural biology
Škerlová, Jana ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
K pochopení funkce proteinu významně přispívá znalost jeho trojrozměrné struktury, obzvláště v případě komplexů s ligandy. Metody strukturní biologie, jako je rentgenová krystalografie, SAXS nebo NMR, jsou proto ve strukturní analyse interakcí proteinů s ligandy široce využívány. V této práci byly tyto metody využity k objasnění molekulární podstaty dvou biologických dějů využívajících proteinové interakce: rentgenostrukturní analysa byla použita ke studiu vazby efektorové molekuly k prokaryotnímu transkripčnímu faktoru, metody NMR a SAXS byly využity ke studiu interakce monoklonální protilátky s proteinovým antigenem. Transkripční regulátor DeoR negativně reguluje expresi katabolických genů pro utilizaci deoxyribonukleosidů a deoxyribosy v bakterii Bacillus subtilis. DeoR se skládá z N-koncové DNA-vazebné domény a z C-koncové efektor-vazebné domény (C-DeoR). Jeho funkce je regulována vazbou nízkomolekulárního efektoru deoxyribosa-5-fosfátu. Vyřešili jsme krystalové struktury C-DeoR ve volné formě a v komplexu s deoxyribosa-5-fosfátem. Strukturní analysa odhalila unikátní vazbu mezi molekulou efektoru a lysylovým zbytkem efektor-vazebného místa prostřednictvím reversibilní dvojné vazby typu Schiffovy base. Fysiologická relevance této vazby byla potvrzena mutačními experimenty a také analysou tvorby...
|
|
|
Expression and characterization of recombinant capsid protein from HIV and its mutants: towards inhibition of virus assembly
Sivá, Monika ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Virus HIV je pro svět hrozbou již třicet let. Způsobuje syndrom získaného selhání imunity (AIDS), při kterém je infikovaný jedinec náchylný k nádorovým onemocněním a život ohrožujícím infekcím. Součástí kombinované antiretrovirové terapie je mnoho léčiv potlačujících množení viru HIV. Ta však pouze zpomalují průběh onemocnění. Protože zatím nebyla objevena žádná dostatečně efektivní léčba, odborníci neustále hledají nové cíle terapeutického zásahu včetně možnosti virus z těla zcela vymýtit. Díky svým multimerizačním vlastnostem je kapsidový protein HIV potenciálním cílem pro inhibici skládání infekční virové částice. N-terminální doména šesti kapsidových proteinů vytváří hexamery a pentametry. Díky proteinové krystalografii a na základě NMR měření víme, že jsou k sobě vázané dimery C-terminální domény. Existují inhibitory, které se vážou na C-terminální doménu, pozměňují její konformaci a mohou tak ovlivnit protein-proteinové interakce dimeru. Tento efekt lze popsat několika metodami, například proteinovou mikrokalorimetrií. Rekombinantní kapsidový protein tzv. divokého typu a jeho C-terminální doména, jež oba dimerují v roztocích i krystalech, byly připravené v bakteriích a dále vyčištěny. Jejich dimerizační konstanta byla změřená izotermální titrační kalorimetrií. Rekombinantní kapsidový protein a jeho...
|
|
|
Charakterizace rekombinantního fragmentu protilátky proti znaku CD3
Písačková, Jana ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Monoklonální protilátka MEM-57 rozpoznává antigen CD3, exprimovaný na T-lymfocytech periferní krve. Komplex membránových glykoproteinů CD3 asociuje s receptorem T-buněk a je zodpovědný za přenos aktivačního signálu. Protilátka MEM-57 má proto výrazný diagnostický a terapeutický potenciál. Mohla by být využita v diagnostice autoimunitních onemocnění, při klasifikaci T-buněčných leukemií nebo jako imunosupresivum při transplantacích. Nejslibnějším terapeutickým využitím protilátky MEM-57 by však byla konstrukce protilátkového fragmentu ve formátu BiTE (z angl. bispecific T-cell engager) pro léčbu rakoviny. Při konstrukci tohoto protilátkového formátu by byl jednořetězcový variabilní fragment protilátky MEM-57 (scFv, z angl. single-chain fragment, variable) spojen v jedné molekule s fragmentem scFv protilátky proti nádorovému antigenu. Tato práce je zaměřena na charakterizaci rekombinantního fragmentu scFv protilátky MEM-57. K heterologní expresi byl použit kmen E. coli BL21 (DE3) a vektor pET22b(+) kódující sekvenci pelB pro akumulaci produktu v periplasmatickém prostoru, vlastní rekombinantní protilátkový fragment scFv MEM-57, epitop c-myc a histidinovou kotvu. Byl vypracován dvoukrokový purifikační protokol zahrnující chelatační a ionexovou chromatografii, který poskytuje dostatečné množství...
|
|
| |
|
|
Studium exprese serinracemasy v CNS pacientů postižených epilepsií
Vorlová, Barbora ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Serinracemasa je enzym, který za pomoci kofaktoru pyridoxal-5'-fosfátu přeměňuje L-serin na D-serin. D-serin se podílí na aktivaci N-methyl-D-aspartátových receptorů pro glutamát - klíčových receptorů zajišťujících přenos nervového vzruchu v savčím mozku. Dysfunkce zmíněných receptorů může vést k různým neuropatologiím, jako je schizofrenie, mozková ischemie, neurodegenerativní onemocnění či epilepsie. Serinracemasa se proto stává slibným farmaceutickým cílem pro léčení těchto chorob. V této práci byly charakterizovány tři monoklonální protilátky proti lidské serinracemase a nejlepší z nich byla využita pro detekci tohoto enzymu v resekovaných vzorcích lidských epileptických tkáních metodou Western blot. Pro správnou interpretaci výsledků byla následně ověřena přesnost zpracování a analýzy jednotlivých vzorků. Nakonec byla měřena aktivita lidské serinracemasy pomocí L-serin-O-sulfátu, substrátu s doposud nejvyšší známou afinitou.
|
|
|
Příprava a charakterizace lidských buněčných kofaktorů retrovirové integrace
Čermáková, Kateřina ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
LEDGF/p75 je lidský buněčný vazebný partner integrasy viru HIV-1. Jak prokázaly nedávné studie, LEDGF/p75 hraje zásadní roli v replikačním cyklu tohoto viru. Jeho funkce v procesu retrovirové integrace je velice dobře prostudována. Byla identifikována doména zodpovědná za interakci s virovou integrasou (IBD) a byly provedeny strukturní studie, které poskytly detailní informace o této interakci. Ostatní jeho úlohy však zatím příliš charakterizovány nejsou. Je jisté, že jako transkripční faktor zasahuje nejen do replikace viru HIV-1, ale také do procesů spojených s buněčným stresem, autoimunity a rozvoje některých druhů rakoviny. Dodnes bylo odhaleno několik přirozených vazebných partnerů LEDGF/p75, jejichž vazba na tento protein je zprostředkovávána stejnou doménou jako vazba intergasy viru HIV- 1; jedním z nich je i protein PogZ. Bylo prokázáno, že vzájemná interakce LEDGF/p75 a PogZ je u obou těchto proteinů zajištěna jejich C-koncovými úseky. Abychom získali informace o této interakci a o topologii vazebných míst LEDGF/p75 a PogZ, rozhodli jsme se provést strukturní studii jejich vazebných domén. Tato strukturní studie je zásadní pro pochopení přirozené buněčné funkce LEDGF/p75 a může pomoci ve vývoji inhibitoru specificky blokujícího interakci LEDGF/p75 a virové integrasy, aniž by došlo k narušení...
|
|
| |
host ::
RSS.