|
|
Studium kinetiky trypsinového štěpení peptidů a chirálních separací biologicky aktivních látek metodou HPLC
Šlechtová, Tereza ; Tesařová, Eva (vedoucí práce) ; Čabala, Radomír (oponent) ; Mikšík, Ivan (oponent)
Dizertační práce se skládá ze dvou tematických částí; první část se zabývá charakterizací trypsinu, enzymu využívaného v proteomickém výzkumu k identifikaci proteinových sekvencí, a rychlostí trypsinového štěpení peptidů. Druhá část je zaměřena na chirální separace biologicky aktivních látek. V první části projektu byla studována kinetika štěpení syntetických peptidů trypsinema vyvinuta metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) pro detekci těchto peptidů a jejich fragmentů. Za použití enzymové reakce v roztoku a metody HPLC byly stanoveny relativní rychlostní konstanty štěpné reakce problematických sekvenčních motivů. Bylo objasněno, které aminokyseliny v okolí štěpného místa zpomalují enzymovou reakci a v jaké poloze vůči štěpnému místu je jejich vliv největší. Dále bylo zjištěno, že trypsin je schopen nízké exopeptidázové aktivity, především při štěpení na konci peptidového řetězce. Dále byly zjištěny a porovnány účinnosti tří chromatografických kolon s imobilizovaným trypsinem. Imobilizace na pevný nosič se využívá pro zvýšení množství enzymu účastnícího se katalytické reakce a pro zajištění lepší opakovatelnosti a reprodukovatelnosti výsledků. Účinnost kolony syntetizované na University of North Carolina at Chapel Hill byla porovnána s účinností dvou komerčně dostupných kolon. Jako...
|
|
|
Cell-biomaterial interactions in hard and soft tissue engineering
Zárubová, Jana ; Bačáková, Lucie (vedoucí práce) ; Mikšík, Ivan (oponent) ; Slepička, Petr (oponent)
Tkáňové inženýrství je interdisciplinární obor, který se snaží vytvořit náhrady poškozených tkání kombinací dvou základních složek, buněk a biomateriálů. Buňky jsou velmi citlivé ke svému mikroprostředí, což umožnuje ovlivňovat jejich chování různými vnějšími faktory nebo změnou vlastností biomateriálů. Úspěšná integrace implantátu do tkáně tak může být podpořena vhodnou drsností povrchu, chemickým složením, hustotou adhezních ligandů, stejně jako dostupností růstových faktorů. Tato práce se zaměřuje především na vývoj ortopedických náhrad a vylepšení aktuálně používaných cévních protéz. Studiem interakcí kostních buněk s biomateriálem bylo prokázáno, že povrchy s kombinovanou nanodrsností a mikrodrsností podporují rozprostření, proliferaci a metabolickou aktivitu těchto buněk. Na příkladu biomateriálů určených pro ortopedické implantáty byl demonstrován vliv chemického složení na proliferaci osteoblastů. Vyšší hustota buněk byla pozorována na kompozitech s 5-15 obj. % nanočástic fosforečnanu vápenatého, zatímco koncentrace 25 obj. % nepodporovala proliferaci buněk, přestože jejich viabilita nebyla ovlivněna. In vivo testy pak odhalily rozdíly mezi kompozity obsahujícími hydroxyapatitové a β-trikalciumfosfátové nanočástice, kde intenzivnější tvorba kostní tkáně byla pozorována na vzorcích...
|
|
|
Morfiem navozené změny membránových a solubilních bílkovin frontální mozkové kůry potkana
Ujčíková, Hana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Mikšík, Ivan (oponent) ; Farghali, Hassan (oponent)
Cílem této dizertační práce bylo analyzovat změny indukované morfiem ve složení proteinů frontální mozkové kůry potkanů vystavených zvyšujícím se dávkám morfia po dobu 10 dní (10-50 mg/kg). První část práce byla zaměřena na fenomén superaktivace/hypersenzitizace adenylylcyklázy (AC), který je považován za jeden z klíčových molekulárních mechanismů podílejících se na vzniku patologických důsledků drogové závisloti. Vzestup aktivity AC představuje kompenzační odezvu funkčně spojenou se snížením odpovědi G proteinů vlivem dlouhodobé expozice morfiu. Výsledky naší pracovní skupiny již dříve prokázaly desenzitizaci odpovědi G proteinů při stimulaci opioidních receptorů (OR) agonisty DAMGO (µ-OR) a DADLE (δ-OR). Funkční aktivita G proteinů byla měřena pomocí vazby [35 S] GTPγS ve frakcích plazmatických membrán (PM) izolovaných z frontální mozkové kůry potkanů vystavených zvyšujícím se dávkám morfia podle stejného protokolu, jaký je uveden v této práci (10-50 mg/kg, 10 dní). κ-OR-stimulovaná vazba [35 S] GTPγS se nezměnila. Byl stanoven obsah všech typů izoforem AC (AC I-IX) ve frakcích PM izolovaných z potkanů ovlivněných morfiem a kontrolních zvířat usmrcených 24 hodin po aplikaci poslední dávky. Imunoblotová detekce byla provedena s využitím specifických protilátek orientovaných proti AC I-IX. Byl...
|
|
|
Interaction of Proteins with Low-molecular Substances in vitro. Effect of Glycation, Substances of Plant Origin, and Combination of these Factors on Function and Spectral Properties of Selected Proteins.
Trnková, Lucie ; Dršata, Jaroslav (vedoucí práce) ; Patočka, Jiří (oponent) ; Mikšík, Ivan (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Katedra biochemických věd Kandidát Ing. Lucie Trnková Školitel Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Název disertační práce Interakce proteinů s nízkomolekulárními látkami in vitro. Vliv glykace, látek přírodního původu a kombinace těchto faktorů na funkci a spektrální vlastnosti vybraných bílkovin. Rostlinné polyfenolické látky se přirozeně vyskytují v lidské stravě a vyznačují se řadou biologických a farmakologických vlastností. Mají schopnost reagovat s nejrůznějšími proteiny včetně enzymů. Velký význam má jejich interakce se sérovým albuminem, jehož jednou z nejvýznamnějších funkcí je vázání, přenos a ukládání řady endogenních a exogenních nízkomolekulárních látek v krevním řečišti. Jedním z cílů práce bylo prostudovat vztahy mezi chemickou strukturou a vazebnými afinitami dvou významných skupin polyfenolických látek, konkrétně hydroxyskořicových kyselin a katechinů (flavanolů), s molekulou sérového abuminu v in vitro modelech pomocí spektrálních (UV-Vis absorpční spektroskopie, metoda zhášení fluorescence) a elektroforetických (nativní a SDS PAGE) metod. Některé polyfenoly způsobily změny v konformaci proteinu a byly zaznamenány určité vztahy mezi jejich strukturou a zjištěnými vazebnými afinitami k sérovému albuminu. Mezi...
|
|
|
Posttranslační modifikace proteinů - jejich analýza a fyziologické aspekty
Mikulíková, Kateřina ; Mikšík, Ivan (vedoucí práce) ; Bílková, Zuzana (oponent) ; Glatz, Zdeněk (oponent)
D i sertační práce se zabývá využitím chromatografických a elektroforetických metod (HPLC, HPLC-MS, CE, CE-MS) pro analýzu posttranslačníc h modifikací proteinů, zejména kolagenu jako zástupce proteinů pojivových bílkovin a jejich následnou identifikaci pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí. První část v teorii je věnována proteinům (albuminu a kolagenu), jejich rozdělení , klasifikaci a metabolickým přeměnám v lidském organizmu. Velká pozornost je zaměřena na kolagen, jeho strukturu a jednotlivé kolagenní typy. Druhá část se zabývá problematikou neenzymatických glykací a jejich vliv na organizmus a blíže seznamuje s produkty posttranslačních modifikací pokročilé glykace. Třetí část shrnuje jednotlivé separační postupy a analýzu posttranslačně modifikovaných proteinů. Experimentální část přibližuje používané chemikálie, využívan~ instrumentaci, materiál a metody použité pro tyto studie. Jsou zde popsány také používané postupy pro přípravu jednotlivých vzorků . Ve výsledcí ch a diskuzi jsou shrnuty veškeré získané výsledky a poznatky. Tato kapitola je rozdělena do dvou částí . První část je věnována problematice pokusů in vivo. Druhá je zaměřena na problematiku pokusů in vitro. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Carbon nanoparticles as promising components of materials for bone tissue engineering
Grausová, Ľubica ; Bačáková, Lucie (vedoucí práce) ; Mikšík, Ivan (oponent) ; Balík, Karel (oponent)
Souhrn Nanotechnologie v tkáňovém inŽenýrství se stala v posledních letech důleŽiýmpředrnětern výzkumu Pro regeneraci tkání se studují různét1p1 nanostrukturovaných materiálů. Důvodem vyuŽití těchto rnateriálťr v tkáňovém inŽenýrství je jejich schopnost napodobovat přirozenou extracelu|ární matrix a tímpodporovat adhezi, růst a diferenciaci buněk. Náš ýzkum by| zaměřen na v|iv vrstev fullerenů, kompozitů uh|íkoqýclr nanotub a syntetického terpolymeru a vrstev rranokrystalického diamantu na adhezi, růst,životaschopnost a diferenciaci lidských osteoblastů linie MG 63. KaŽdý z těchto materiálů podporoval kolonizaci svého povrclru buňkami. Na kontirruálrrích vrstvách fu1lerenů Coo, deponovanýclr na uhlíkové kompozity s uhlíkovou matricí vyáuženou uhlíkovými vlákny byla sice populačníhustota buněk nižšív porovnání s uhlíkov'ým kompozitem bez fullerennílro filmu, ale tyto buriky dosahovaly větší adhesní plochy, coŽ bylo dale spojeno s dobře q'vinuým beta- aktinov'ým cýoskeletem a foká|ními adhezními plaky s obsahem vinkulinu. Na kompozitech uhlíkových nanotub a terpolymeru složenélioz po|ýetrafluoroeýlenu, po|ypropylenu a poly.viny|difluoridu' byla adhese buněk, jejich rozprostření, tvorba fokálníclr adlresních plakůa aktinového cytoskeletu, viabilita a buněčnýrůstznačnězlepšena v porovnání s čisýmterpolymerem....
|
|
|
ANALYSIS OF NON-ENZYMATIC POSTTRANSLATIONAL MODIFICATED (GLYCATED) ALBUMIN BY NANO-LC/MS/MS
Šťastná, Zdeňka ; Pataridis, Statis ; Sedláková, Pavla ; Mikšík, Ivan
Posttranslational modifications of proteins are important reactions, which significantly affect the function of proteins in the organism. In principle, they can be divided into enzymatic and non-enzymatic modifications. Non-enzymatic reactions include glycation (earlier called nonezymatic glycosylation), which plays an important role in the development of chronic complications of diabetes mellitus, uremia, in the process of aging and degeneration of the brain.This work deals with the study of glycated albumins (human serum albumin and bovine serum albumin). Methodologically we used nano-liquid chromatography coupled to Q-TOF mass spectrometer. In vitro modified proteins were cleavaged by trypsin and arising peptides were separated on C18 nano column with trap-column. Peptides and their modifications were analysed by high-resolution Q-TOF mass spectrometer MaXis with precision determination of mass below 2 ppm. We found some modifications of proteins. Besides well known carboxymethyllysine new ones were determined - create mass shift 78, 132 and 218. Origin of these modifications is discussed and possible structure is presented. All found modifications were allocated to the structure of proteins and reactivity to various oxo-compounds was also examined
|
|
|
Open-tubular capillary electrochromatography with bare gold nanoparticles-based stationary phase applied to separation of trypsin digested proteins
Mikšík, Ivan ; Lacinová, Kateřina ; Zmatlíková, Zdeňka ; Sedláková, Pavla ; Král, V. ; Sýkora, D. ; Řezanka, P. ; Kašička, Václav
Open-tubular capillary electrochromatography (OT-CEC) using bare gold nanoparticles-based stationary phase has been applied to separation of tryptic peptide fragments of native and glycated proteins, bovine serum albumin and human transferrin. OT-CEC with bare gold nanoparticles stationary phase was found to be a suitable technique for separation of complex peptide mixtures originating from enzymatic (tryptic) digestion of native and glycated bovine serum albumin and human transferrin, and for glycation studies of these proteins.
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.