|
| |
|
|
Proteolytické enzymy krevničky střevní (Schistosoma mansoni): patobiochemie a využití v biomedicíně
Leontovyč, Adrian ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevní motolice rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu, které postihuje celosvětově přes 250 milionů lidí a představuje spolu s malárii nejvýznamnější parazitózy. Vzhledem k nebezpečí vzniku rezistence k jedinému používanému léku jsou intenzivně hledány nové způsoby terapie schistosomózy. Proteolytické enzymy krevniček jsou klíčové pro jejich přežití v hostiteli, a proto jsou slibnými cílovými molekulami pro vývoj nových chemoterapeutik a vakcín. Tato práce se zabývá dvěma proteasami z krevničky střevní (Schistosoma mansoni), které byly připraveny jako rekombinantní proteiny a komplexně funkčně charakterizovány. První z nich je serinová proteasa SmSP2, která je lokalizovaná na povrchu dospělců a sekretovaná do krve hostitele. Byla identifikována jako vasodilatační a fibrinolytický faktor a navržena její modulační role při interakci parazita s hostitelem. Druhou zkoumanou proteasou je cysteinový katepsin SmCL3, který se účastní trávení hostitelských krevních proteinů sloužících krevničkám jako zdroj živin. Byly identifikovány účinné peptidomimetické inhibitory SmCL3, u nichž byla prokázána antischistosomální aktivita v testech s živými parazity. Disertační práce přináší nové významné poznatky o proteasách krevničky S. mansoni, jejich patobiochemii a inhibiční...
|
|
|
Rekombinantní exprese a funkční charakterizace rostlinných Kunitzových inhibitorů
Rybáriková, Renata ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
PDI (z angl. "potato cathepsin D inhibitor") a NID (z angl. "novel inhibitor of cathepsin D") z lilku brambor (Solanum tuberosum) patří do proteinové rodiny Kunitzových inhibitorů (rodina I3 podle databáze Merops). Tyto isoinhibitory s molekulovou hmotností cca 20 kDa a typickou prostorovou architekturou β-trojlístku inhibují aspartátové a serinové peptidasy. Byly připraveny konstrukty pro rekombinantní expresi PDI a NID v kvasinkovém expresním systému Pichia pastoris a vybrány kolonie pro jejich účinnou produkci. Oba proteiny byly identifikovány v kultivačním médiu pomocí hmotnostní spektrometrie a N-koncového sekvenování. Pro PDI byl navržen isolační protokol se třemi chromatografickými kroky. Purifikovaný rekombinantní PDI byl porovnán s nativním PDI z přírodního zdroje a byly prokázány analogické funkční vlastnosti. Analýza inhibiční specifity dále ukázala, že PDI inhibuje vybrané aspartátové peptidasy rodiny A1 a serinové peptidasy rodiny S1 včetně relevantního enzymu hmyzího původu. To podporuje hypotézu o funkci Kunitzových inhibitorů jako obranných molekul rostlin proti herbivornímu hmyzu. Připravené inhibitory budou využity pro analýzu reaktivních center proti cílovým peptidasám pomocí proteinové krystalografie. Klíčová slova: proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, aspartátové a serinové...
|
|
|
Vlastnosti specifických protilátek prionových chorob a možnosti jejich využití
Šafaříková, Eva ; Holada, Karel (vedoucí práce) ; Mareš, Michael (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Souhrn Transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE) jsou neurodegenerativní onemocnění charakterizovaná ukládáním patologické formy prionového proteinu (PrPTSE ) v mozku. V současnosti je PrPTSE jediný specifický biochemický marker lidských a zvířecích TSE. Laboratorní diagnostika je založena na průkazu rezistentního jádra PrPTSE (PrPres) po štěpení vzorku mozkového homogenátu proteinázou K. PrPres je posléze detekován pomocí western blotu nebo imunometodami. Obě metody jsou však obtížně standardizovatelné, časově náročné a nejsou schopné zachytit k proteolytickému štěpení senzitivní formy PrPTSE . V této práci jsme se zaměřili na přípravu nového typu testů založených na průkazu PrPTSE bez nutnosti štěpení proteinázou K či jiným enzymem. Působením glukózy a jiných redukujících cukrů v organismu vzniká spektrum produktů zvaných koncové produkty glykace. Vzhledem k dlouhodobému ukládání prionových depozit v mozku dochází ke glykaci i u PrPTSE . Detekce glykovaného PrPTSE by tak mohla sehrát roli diagnostického markeru. V rámci první části studie jsme se zaměřili na přípravu monoklonálních protilátek specifických pro glykovaný prionový protein. Připravili jsme bakteriálně exprimovaný rekombinantní lidský prionový protein (rhPrP). Na rhPrP jsme působili kyselinou glyoxalovou za vzniku karboxymethyl...
|
|
|
Nové inhibiční mechanismy regulace aktivity katepsinu D
Hánová, Iva ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Aspartátová proteasa katepsin D (KatD) je spojená s řadou patologií, a proto jsou zkoumány molekulární mechanismy regulace její aktivity, které mají potenciální využití v biomedicíně. Tato disertační práce je zaměřena na nové přirozené endogenní inhibitory KatD, analýzu jejich interakce a na odvození syntetických inhibičních biomimetik. Byly identifikovány dvě skupiny inhibitorů KatD jako prvních specifických endogenních regulátorů tohoto enzymu. (1) Sfingolipidy jsou komplexními modulátory lidského KatD v závislosti na struktuře. Zatímco sfingosiny a ceramidy jsou inhibitory KatD, jejich fosforylované deriváty naopak fungují jako aktivátory KatD. Byla nalezena korelace mezi působením těchto sfingolipidů na KatD a jejich modulačním účinkem na nádorové buňky. (2) Analýzou KatD parazitárního původu byl identifikován nový mechanismus inhibice, který je konzervovaný u aspartátových proteas rodiny pepsinu. Autokatalytickým působením je z proenzymu KatD uvolněn peptidový fragment, který působí jako alosterický inhibitor, jenž se váže do exomísta na povrchu aktivního enzymu. Dále byly připraveny syntetické makrocyklické inhibitory lidského KatD, které mimikují vazebnou konformaci bakteriálního inhibitoru pepstatinu v aktivním místě aspartátových proteas. U těchto biomimetických inhibitorů lze na základě...
|
|
| |
|
|
Regulace aktivity aspartátových a serinových proteas pomocí selektivních přirozených inhibitorů
Srp, Jaroslav ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Proteasy se účastní řady významných fyziologických procesů a jejich nedostatečná kontrola je spojena s řadou patologií. Přirozené inhibitory představují účinný nástroj pro regulaci jejich aktivity. Disertační práce se zaměřuje na živočišné a rostlinné inhibitory aspartátových a serinových proteas a přináší identifikaci, biochemickou charakterizaci a strukturní popis jejich mechanismu inhibice. Rostlinné inhibitory z Kunitzovy rodiny jsou produkované jako obranné proteiny s unikátní schopností blokovat široké spektrum proteas. V této práci byl s využitím metod funkční proteomiky popsán trávicí proteolytický systém mandelinky bramborové, herbivorního škůdce lilkovitých rostlin. Byl podán přímý důkaz, že trávicí aspartátové a serinové proteasy tohoto herbivora jsou efektivně blokovány pomocí dvou Kunitzových inhibitorů (nazývaných PCDI a PSPI), které jsou produkované v lilku brambor. Pomocí strukturní analýzy byly na molekulách PCDI a PSPI identifikovány nové typy reaktivních center pro inhibici aspartátových proteas typu katepsinu D a serinových proteas typu trypsinu a chymotrypsinu. Popis reaktivního centra na PCDI inhibitoru společně s krystalovou strukturou trávicí proteasy typu katepsinu D mandelinky bramborové umožnilo vysvětlit mechanismus jejich vzájemné interakce. Pro lidský katepsin D byly...
|
|
| |
|
| |
|
|
Parazitární proteáza SmCB2 jako cílová molekula pro léčbu schistosomózy
Bakardjieva, Marina ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma jsou parazitické motolice, které způsobují schistosomózu, závažné onemocnění postihující více než 240 mil. lidí. Proteolytický systém krevniček je nezbytný pro jejich životaschopnost; účastní se důležitých procesů při interakci s hostitelem, jako je trávení potravy, invaze a migrace tkáněmi. Proto jsou proteázy krevniček perspektivními cílovými molekulami pro terapeutický zásah při léčbě schistosomózy. Tato práce se zabývá proteázou katepsin B2 (SmCB2) z krevničky střevní (S. mansoni), jejíž biochemické vlastnosti a biologická funkce nebyly podrobně studovány. Rekombinantní SmCB2 byl připraven pomocí kvasinkového a bakteriálního expresního systému a chromatograficky purifikován. V aktivitním testu in vitro byly identifikovány první účinné inhibitory SmCB2 blokující jeho proteolytickou aktivitu v submikromolárních koncentracích. Byly připraveny specifické polyklonální protilátky proti SmCB2, které byly použity pro imunomikroskopickou lokalizaci této proteázy v povrchové vrstvě parazita. Pomocí ELISA analýzy bylo zjištěno, že SmCB2 je rozeznáván jako parazitární antigen imunitním systémem hostitele v myším modelu schistosomózy. Práce přináší významné informace o SmCB2 jako potenciální cílové molekule pro syntetické inhibitory a jako novém antigenu pro vakcinační studie.
|
host ::
RSS.