|
|
Studium mechanismu rozpoznávání DNA transkripčním faktorem FOXO4
Zusková, Iva ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Forkhead transkripční faktor FOXO4 se podílí na kontrole řady buněčných dějů, jako jsou např. metabolismus, buněčný cyklus, apoptóza, oprava poškozené DNA či ochrana vůči oxidativnímu stresu. Krystalová struktura DNA-vazebné domény tohoto proteinu s navázanou DNA ukázala, že FOXO4 interaguje s DNA podobně jako jiné forkhead proteiny. DNA- vazebný povrch je tvořen zejména helixem H3, který se váže do velkého žlábku molekuly DNA, a dále N-koncovým segmentem a flexibilními ohyby na C-konci domény. Nicméně řada otázek, zejména ohledně mechanismu regulace specifičnosti při rozpoznávání DNA a úlohy jednotlivých částí domény v tomto procesu, zůstává stále nejasná. V rámci této diplomové práce byla studována interakce DNA-vazebné domény FOXO4 s DNA o různých sekvencích. Tento protein a řada jeho mutantů byla exprimována a purifikována a interakce s DNA byly studovány pomocí metod fluorescenční spektroskopie a resonance povrchového plasmonu. Výsledky těchto experimentů ukázaly, že nukleotidová sekvence na 5′ konci od hlavního vazebného motivu ovlivňuje stabilitu komplexu DNA-vazebné domény FOXO4:DNA. Dále se podařilo objasnit význam jednotlivých aminokyselin FOXO4, které se podílejí na vazbě na DNA, na stabilitě výsledného komplexu.
|
|
|
Strukturní a funkční charakterizace inhibice flavivirové methyltransferázy.
Todd, Matthew Zagorey ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Honzejková, Karolína (oponent)
Viry rodu flavivirus, patřící do rodiny Flaviviridae, jsou rozšířenou skupinou virových patogenů, které představují globální hrozbu pro lidské zdraví. Následky infekce jsou neurologické nebo jiné onemocnění jako je encefalitida, meningitida, mikrocefalie nebo krvácivá horečka, přičemž přímá protivirová léčba existuje pouze proti některým členům flavivirů jako je Virus žluté zimnice (YFV) nebo Virus japonské encefalitidy (JEV). Genom flavivirů je pozitivní jedno-vláknová RNA, po jejíž translaci vzniká dlouhý virový polyprotein štěpen hostitelskými a virovými proteasami na strukturální a nestrukturální proteiny. Nestrukturální protein 5 (NS5) je tvořen C-koncovou doménou s funkcí RNA- dependentní RNA-polymerasy (RdRp) a N-koncovou doménou s funkcí methyltransferasy (MTasa). Flavivirové MTasy katalyzují poslední krok v tvorbě čepičky genomové RNA, která hraje klíčovou roli v procesech virové translace, replikace a úniku před imunitním systémem hostitele. Kvůli její konzervativní povaze je flavivirová MTasa slibným cílem terapeutického zásahu. Analýza její struktury je nezbytná pro vývoj širokospektrálních inhibitorů a léčiv proti onemocněním způsobené flaviviry. Klíčová slova Flaviviry, Virus St. Louisské encefalitidy (SLEV), Flavivirová methyltransferasa (MTasa), N-7 methylace, 2'-O methylace.
|
|
|
Strukturní a funkční charakterizace inhibice flavivirové methyltransferasy
Kúdelová, Veronika ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Do středu zájmů velkého množství vědeckých skupin se v poslední době čím dál tím více dostávají virové agens. Neopomenutelnou a světově hojně rozšířenou skupinou těchto virů jsou flaviviry, mezi které se řadí např. virus Zika, viry horečky Dengue, virus klíšťové encefalitidy či virus západonilské horečky. Mezi těmito viry panuje značná diverzita, nicméně lze nalézt velmi konzervované proteiny, které se vyskytují napříč celým tímto virovým rodem. Největším a nejvíce konzervovaným proteinem kódovaným flaviviry je nestrukturní protein NS5, který se skládá ze dvou domén: methytransferasové (MTasy) a RNA-dependentní RNA-polymerázové domény (RdRp). MTasa umožňuje viru díky methylaci jeho genomu iniciovat translaci a zároveň i maskovat jeho RNA před imunitním systémem hostitele. Blokací aktivního místa tohoto enzymu malou molekulou by se dala zastavit virová infekce nejen u jednoho viru, ale, vzhledem k vysoké konzervovanosti MTas, i u všech dalších virů rodu flavivirus. Tato diplomová práce se zabývá právě zmíněnou MTasou proteinu NS5, konkrétně u viru západonilské horečky (WNV). Po navržení insertu, který kóduje doménu WNV MTasy, jeho amplifikaci a ligaci do plasmidu, byl expresí a následnou purifikací připraven rekombinantní protein WNV MTasy. Následně byly vytvořeny komplexy proteinu s malými...
|
|
|
Biofyzikální charakterizace proteinového komplexu CAR/RXR s jeho vazebnými partnery
Duchoslav, Vojtěch ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Konstitutivní androstanový receptor (CAR) hraje v organismu významnou roli xenosenzoru, a proto je hojně exprimován v ledvinách, játrech, žlučníku a v epitelu tenkého střeva, kde dochází k biotransformaci xenobiotik. CAR je také důležitým faktorem pro eliminaci žlučových kyselin a bilirubinu. Taktéž se ukázalo, že CAR má významnou roli v regulaci metabolismu glukózy a lipidů. Narušení metabolismu tuků a glukózy je častou příčinou kardiovaskulárních a metabolických onemocnění, jako jsou ateroskleróza, cukrovka druhého typu, obezita a inzulínová rezistence. Tento stav nazýváme metabolickým syndromem a mívá za následek vážné poškození orgánů. Díky schopnosti ovlivňovat metabolismus se CAR, respektive jeho komplex s RXRα (retinoidní X receptor α), stal slibným biologickým cílem pro výzkum potenciálních léčiv metabolického syndromu. Cílem této diplomové práce byla především strukturní charakterizace proteinového komplexu CAR/RXRα spolu s agonistou IV676*HCl, která by detailně popsala interakci této malé molekuly s receptorem. Získané strukturní informace by byly využity při návrhu nových agonistů.
|
|
|
Structure-assisted development of a continuous carboxypeptidase assay
Rakhimbekova, Anastasia ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII) je zinek-dependentní karboxypeptidasa s vysokou hladinou exprese u karcinomu prostaty. Vzhledem k tomu, že daný enzym představuje ověřený cíl pro terapii a zobrazování rakoviny, je vývoj nových ligandů specifických pro GCPII stále předmětem aktivního akademického a průmyslového výzkumu. Stávající analýzy pro screening knihoven inhibitorů a stanovení účinnosti inhibitorů nejsou však optimální. Tato diplomová práce je zaměřena na vývoj malých interně zhášených sond, které by mohly být použity pro kontinuální měření enzymatické aktivity GCPII. Tyto sondy jsou odvozeny z přirozených substrátů GCPII a sestávají z páru fluorofor/zhášeč spojeného GCPII- hydrolyzovatelným linkerem. Nejprve jsem charakterizovala biofyzikální vlastnosti sond a poté stanovila kinetické parametry jejich hydrolýzy GCPII. Optimalizovaná metoda pro stanovení karboxypeptidasové aktivity byla použita pro určení IC50 u několika GCPII-specifických inhibitorů. Nakonec komplexy mezi neaktivním enzymem a uvedenými sondami byly kokrystalizovány, a pro jeden z komplexů byly provedeny upřesnění a analýza struktury. Naše data naznačují, že sondy jsou zapojeny do nekovalentních interakcí se stejnými aminokyselinovými zbytky aktivního místa enzymu jako přirozené substráty. Vyvinutá analýza může být...
|
|
|
SARS-CoV-2 methyltransferázy jako cíl terapeutického zásahu
Kocek, Hugo ; Nencka, Radim (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Nový koronavirus SARS-CoV-2 (z počátku též označovaný "nCoV2019") se stal od března roku 2020 součástí našich životů a téměř přes noc obrátil naše životy "vzhůru nohama". Tento vir se přenáší kapénkami a způsobuje respirační onemocnění COVID-19, které může mít v komplikovaných případech velmi závažný až fatální průběh. Doposud nebyla vynalezena žádná efektivní léčebná metoda a vakcíny jsou momentálně velkou nadějí. Ačkoli poskytují vysokou míru ochrany vůči SARS-CoV-2, je důležité podotknout, že nemusí být plně efektivní vůči stále se objevujícím novým mutacím SARS-CoV-2. V průběhu pandemie byla vyzkoušena řada již schválených léků (např. favipiravir, toremifen či hydroxychlorochin), ale žádný z těchto léků v klinických studiích neprokázal signifikantní účinnost proti SARS-CoV-2. Jediným schváleným antivirotikem pro použití u hospitalizovaných pacientů je v současné době nukleotidový analog remdesivir, jehož účinnost byla prokázána v klinických testech, ale je patrně značně závislá na době podání a celkovém stavu pacienta. Vývoj nových antivirotik je proto nezbytný, neboť se jedná již o třetí korovirus od počátku 21. století s pandemickým potenciálem, a proto můžeme očekávat příchod dalších variant v budoucnosti. Tato práce se zaměřuje na S-adenosylmethionin-dependentní methyltransferázy nsp14 a...
|
|
|
Příprava vybraných rekombinantních proteinů viru Aichi a dalších kobuvirů
Ludvík, Tomáš ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Petrvalská, Olívia (oponent)
Virová 2Apro zastává mnoho důležitých funkcí v životním cyklu viru. Jedná se o proteasu, jež se podílí na štěpení virového polyproteinu v úseku VP1/2A. Struktura proteinu obsahuje tzv. aktivní místo, díky kterému dokáže protein vázat různé substráty v hostitelské buňce, což je esenciální pro virovou infekci. Pomocí 2Apro dokáže virus obejít imunitní odpověď hostitele a zastavit produkci klíčových hostitelských proteinů. Proto je proteasa 2Apro vhodný cíl pro zásah antivirotiky. V rámci této práce byly připraveny dva rekombinantní proteiny 2Apro z Aichi viru a Coxsackie viru B3. Jedná se o viry z rodiny Picornaviridae, které patří mezi lidské patogeny, jež v některých případech způsobují závažná onemocnění. Aichi virus je původcem gastroenteritidy a Coxsackie virus B3 v nejhorších případech způsobuje dilatační kardiomyopatii. Kardiomyopatie vede ke špatné funkci srdce důsledkem jeho rozšíření, čímž může dojít až k srdečnímu selhání. Klíčová slova: rekombinantní proteiny, 2Apro , Aichi virus, Coxsackie B3 virus
|
|
|
Structural and functional study of viral RNA polymerases
Dubánková, Anna ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Plevka, Pavel (oponent)
Virové RNA dependentní RNA polymerázy (RdRp) jsou enzymy nezbytné pro množení RNA virů. Obecná funkce RdRp je pro všechny RNA viry stejná: RdRp rozpozná virovou RNA, nasedne na ni a syntetizuje komplementární řetězec RNA. Série těchto kroků je pro virovou infekci naprosto nepostradatelná. Je důležité si uvědomit, že neinfikovaná buňka RNA nereplikuje. Hostitelská buňka přirozeně neexprimuje žádné RdRp. Pro můj výzkum jsem si vybrala RdRp, protože jsou nezbytné pro virovou replicakci a tudíž excelentní cíl pro virovou terapii. V této studii jsou do hloubky charakterizovány polymerázy z rodiny picornavirů a flavivirů. Picornavirová replikace je lokalizovaná ve viry indukovaných, membránových strukturách, které nazýváme replikační organely (RO). V těchto RO je virová polymeráza lokalizovaná na membráně. Nalezli jsme podmínky, ve kterých se polymeráza váže na membránu. Následně byla studována aktivace picornavirových polymeráz, která je indukována inzercí první aminokyseliny do středu proteinu. V této studii jsou rovněž diskutovány RdRp z rodiny flavivirů, konkrétně z viru žluté zimnice (YFV) a Zika viru (ZIKV). Studie prezentuje první strukturu polymerázy z YFV (v plné délce) a model ZIKV polymerázy v komplexu s RNA. Model ZIKV poskytuje strukturní informaci o aktivním místě potřebnou k "dockingu" ligandů.
|
|
|
Strukturní studie inhibičních mechanismů kinas fosfatidylinositolu.
Gregor, Jiří ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
+ssRNA viry po vstupu do buňky tvoří platformy pro svoji replikaci - replikační organely. V těchto oblastech je díky činnosti fosfatidylinositol 4-kinasy zvýšená koncentrace PI4P, který vytváří vhodné prostředí pro vazbu virové polymerasy 3DPOL . Jednou z těchto kinas je PI4KB, která je vázána na membránu prostřednictvím ACBD3 proteinu, který je sám k membráně vázán interakcí s giantinem. Některé kobuviry a enteroviry z čeledi Picornaviridae pomocí nestrukturního proteinu 3A vytěsní ACBD3 protein z vazby s gigantinem a přemístí ho z Golgiho aparátu do replikační organely. Na ACBD3 se zde váže PI4KB a následně katalyzuje vznik PI4P. V Golgiho aparátu byly objeveny pouze dva proteiny - TBC1D22A a TBC1D22B - které se váží do stejného místa ACBD3 proteinu jako PI4KB. Cílem této práce bylo ověřit interakci peptidů z proteinů TBC1D22A a TBC1D22B s ACBD3 proteinem a zjistit sílu této interakce. Dalším cílem bylo vykrystalizovat komplexy těchto interakčních partnerů a následně vyřešit jejich trojrozměrné struktury. Bylo zjištěno, že interakce ACBD3 proteinu s peptidy TBC1D22A a TBC1D22B je mnohem slabší než interakce ACBD3 s PI4KB. Podařilo se připravit krystaly komplexu ACBD3 s TBC1D22A, ale bohužel difraktovaly jen k velmi nízkému rozlišení, a tudíž struktura nemohla být vyřešena.
|
|
|
Molekulární mechanismy regulace forkhead transkripčního faktoru FOXO4
Bouřa, Evžen ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
8. Závěr H|avním cílem předkládané práce by|o studium molekulárních mechanismů interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a mechanismus regulace jeho vazby na DNA, zejména úloha fosforylace proteinkinasou B a regulačnífunkce l4-3- 3 proteinu. Naše qýsledky ukazují, žepro vazbu na DNA jsou u forkhead transkripčníhofaktoru FoXo4 dů|ežitéobě hraničníoblasti forkhead doméIry * jak N-koncová smyčka,která se nachází před helixem Hl, tak C-koncová část známá jako křídlo W2. Bylo zjištěno, žeodstranění jedné z těchto částís|abě snižuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD, zatímco současnéodstranění obou těchto ob|astí výrazně inhibuje vazbu na DNA. Dále jsme se zaměřili na úlohu fosforylace C-koncové části forkhead domény. FoXo4 má tři fosforylačnímísta pro proteinkinasu B, z nichž jedno se nacházi přímo ve forkhead DNA vazebné doméně a to na jejím C-konci v oblasti Kíd|a W2. Zjistili jsme, že v přítomnosti N-koncové smyčky má fosfory|ace kříd|a W2 proteinkinasou B pouze ma|ý v|iv navazbu DNA. Na druhé straně v nepřítomnostitéto smyčky fosforylace křídla W2 silně inhibuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD. Yazba 14-3-3 proteinu efektivně snižuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD, ať užje N-koncová smyčka přítomna nebo ne. Naše ýs|edky ukazují, Že jak N-koncová, tak C-koncová část FoXo4-DBD jsou dů|eŽitépro...
|
host ::
RSS.