|
|
Vývoj LC-MS metody pro látky využívané pro stanovení aktivity cytochromu
Smolík, Martin ; Lochman, Lukáš (vedoucí práce) ; Horáček, Ondřej (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Kandidát: Bc. Martin Smolík Vedoucí práce: PharmDr. Lukáš Lochman, Ph.D. Konzultant: prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Název diplomové práce: Vývoj LC-MS metody pro látky využívané pro stanovení aktivity cytochromu Cytochromy P450 (CYP450) jsou enzymy s klíčovou rolí v metabolismu xenobiotik a některých endobiotik (cholesterol, steroidní hormony, eikosanoidy). Vyskytují se v játrech, gastrointestinálním traktu, plicích a ledvinách. Stanovení aktivity CYP450 je vhodným nástrojem pro zjištění možných lékových interakcí vznikajících z důvodu inhibice či indukce různých izoforem tohoto enzymu. Tato diplomová práce je věnována vývoji a validaci nové analytické metody využívající kapalinovou chromatografii spojenou s tandemovou hmotnostní spektrometrií pro stanovení aktivity CYP450 izoforem 3A4, 2C9 a 2B6, které jsou nezbytné pro metabolismus mnoha léčiv a biologicky aktivních látek. V rámci diplomové práce byla vyvinuta metoda poskytující rychlé, přesné a spolehlivé měření aktivity těchto enzymů na základě kvantifikace specifických substrátů CYP450, a to midazolamu (3A4), diklofenaku (2C9) a bupropionu (2B6) a jejich příslušných hydroxylovaných metabolitů v buněčném médiu. Analyty byly...
|
|
|
Využití HPLC v chirálních separacích VIII.
Šlapáková, Tereza ; Horáček, Ondřej (vedoucí práce) ; Lochman, Lukáš (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Studentka: Bc. Tereza Šlapáková Vedoucí diplomové práce: RNDr. Ondřej Horáček, Ph.D. Konzultant diplomové práce: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Název diplomové práce: Využití HPLC v chirálních separacích VIII. Karborany jsou vysoce stabilní, hydrofobní, anorganické sloučeniny, které vychází z ikosahedrální struktury tvořené z atomů bóru. Někteří zástupci karboranů jsou chirální, což je dáno především asymetrickou substitucí. S ohledem na možné budoucí využití chirálních karboranů v praxi je nutné vyvinout rychlé metody, které umožní spolehlivé rozdělení enantiomerů. Pro aplikaci do praxe je výhodná především metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie, jelikož je široce využívaná, robustní a aplikovatelná do velkého spektra oborů. Cílem práce bylo otestovat chování chirálních karboranů na polysacharidových kolonách v HPLC. Nejprve byl proveden screening gradientovou metodou s využitím šesti chirálních stacionárních fází na bázi polysacharidů, složkou A mobilní fáze byl 50 mmol/l NaClO4, složkou B ACN či MeOH. Následně proběhl převod gradientové metody na izokratickou. Dalším cílem bylo optimalizovat podmínky a vytvořit tak databázi separací, která může sloužit k dalšímu...
|
|
|
Separace molekulárních sond pomocí kapilární elektroforézy
Hof, Maxim ; Kučera, Radim (vedoucí práce) ; Lochman, Lukáš (oponent)
Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova Kandidát: Maxim Hof Školitel: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Konzultant: Mgr. Ondřej Horáček Název práce: Separace molekulárních sond pomocí kapilární elektroforézy Oligonukleotidy jsou organické molekuly, které nacházejí uplatnění v oblastech jako je biotechnologie, molekulární biologie, diagnostika a terapie. Pro použití oligonukleotidů jako molekulárních sond je nutné oligonukleotidy kovalentně modifikovat např. fluorescenčním barvivem a zhášečem. Produkty těchto značících reakcí jsou dvojitě značená oligonukleotidová sonda, ale také vedlejší produkty, jako je neznačený oligonukleotid a oligonukleotidy značené buď fluorescenčním barvivem nebo zhášečem. Produkty této reakce je nutné separovat, což je těžištěm této diplomové práce. Separace takto dvojitě značených oligonukleotidových sond byla dosud prováděna pouze v chromatografických podmínkách. Cílem této práce je prozkoumat využití kapilární elektroforézy pro tuto separaci. Konkrétně bylo zkoumáno použití kapilární elektroforézy pro separaci oligonukleotidových sond jednoduše značených BHQ zhášečem od dvojitě značených BHQ zhášečem s fluorescenčním barvivem 6-FAM (BHQ-FAM) a jednoduše značených oligonukleotidových sond...
|
|
|
Kvantitativní analýza inhibitorů tyrozinkinázy metodou kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí
Maier, Jan ; Pávek, Petr (vedoucí práce) ; Lochman, Lukáš (oponent)
Předložená diplomová práce je věnována kvantitativnímu stanovení inhibitorů tyrozinkinázy, konkrétně imatinibu a nilotinibu, metodou kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. Za účelem sledování hladin těchto léčivých látek v séru či plazmě zejména pacientů s chronickou myeloidní leukémií, v menší míře pak pacientů s gatrointestinálním stromálním tumorem, byla na Ústavu klinické biochemie a diagnostiky Fakultní nemocnice v Hradci Králové vyvinuta nová metoda pro jejich stanovení a monitorování. Hlavním úkolem v souladu s vypracováváním diplomové práce bylo metodu plně optimalizovat a validovat. Tato metoda pro stanovení inhibitorů tyrozinkinázy byla na pracovišti nejdříve prováděná pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie se spektrofotometrickou (UV) detekcí. V rámci modernizace laboratorní technologie se postupem času přešlo na metodu prováděnou pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. Analyty s jejich vnitřními standardy byly nejprve zpracovány extrakčním postupem kapalina-kapalina, poté byly isokraticky separovány na koloně C18 s reverzní fází. Následně byly oba analyty detekovány s využitím tandemové hmotnostní spektrometrie typu trojitého kvadrupólu s ESI iontovým zdrojem v pozitivním módu. V rámci validace metody byla ověřena její preciznost a správnost,...
|
|
|
Modifikace sorbentu pro SPE
Mrenková, Nikola ; Lochman, Lukáš (vedoucí práce) ; Váňová, Nela (oponent)
UNIVERZITA KARLOVA FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutickej chémie a farmaceutickej analýzy Kandidát: Nikola Mrenková Školiteľ: PharmDr. Lukáš Lochman, Ph.D. Názov diplomovej práce: Modifikácia sorbentu pre SPE Úprava vzorku patrí medzi najkritickejší bod v chromatografickej analýze vzoriek biologického materiálu, závisí na nej celkový úspech chromatografickej analýzy. Komplexný charakter biologických vzoriek a nízka koncentrácia cieľových analytov viedli k vývoju rôznych techník selektívnych úprav vzoriek. Pre svoju univerzálnosť a selektivitu je extrakcia na pevnej fáze (SPE) jednou z najrozšírenejších metód. Grafén pre svoje unikátne vlastnosti (veľký špecifický povrch, delokalizovaný systém π elektrónov, hydrofóbny charakter) sa stal jedným z vhodných kandidátov ako látka pre vývoj nového typu sorbentu pre SPE. Diplomová práca bola zameraná na štúdium vlastností modifikovanej stacionárnej fáze pre SPE založenej na graféne. Konkrétne sa jednalo o naviazanie grafén-oxidových (GO) plátov na aminosilikagél prostredníctvom amidovej väzby medzi karboxylovými skupinami GO a aminoskupinami aminosilikagélu, s následnou hydrazínovou redukciou na redukovaný grafén-oxid (rGO). Pre štúdium vlastností pripraveného sorbentu boli vybrané modelové analyty s rozdielnymi fyzikálno-chemickými...
|
|
|
Sledování oxidačního stresu HPLC metodami
Kalíšková, Tereza ; Váňová, Nela (vedoucí práce) ; Lochman, Lukáš (oponent)
Reaktivní formy kyslíku a dusíku mají v organismech svou fyziologickou úlohu, ale jejich nadměrná tvorba poškozuje buňky a může vyústit v řadu onemocnění. Interakcí reaktivních forem kyslíku a dusíku s biomolekulami dochází k jejich poškození. Poškozené molekuly lipidů, proteinu i DNA poté slouží jako biomarkery oxidačního stresu a umožňují jeho hodnocení. Oxidační stres může být vyvolán také vnějšími faktory například léčivy, ten se poté může projevit jako nežádoucí a toxické účinky. Pro sledování bezpečnosti léčiv je tedy důležité sledovat schopnost léčiva vyvolat oxidační stres. Pro stanovení malondialdehydu z buněčné pelety jako biomarkeru lipoperoxidace byla vyvinuta metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometii. Největší pozornost byla věnována optimalizaci úpravy vzorku pomocí deproteinace, derivatizace a extrakce na tuhou fázi. Metoda byla validována s přijatelnou specifitou, přesností, precizností výtěžnosti i matricovými efekty a vyhovuje tak požadavkům Evropské lékové agentury na validaci bioanalytických metod. Metodou lze stanovit intracelulární malondialdehyd v rozmezí koncentrací 0,1-2 μmol∙dm-3. Metoda byla úspěšně použita na analýzu biologických vzorků z in vitro experimentu, kde bylo hodnoceno množství malondialdehydu v HepG2 buňkách...
|
|
|
Testování potenciálního využití chirálních iontových kapalin s dlouhým řetězcem pro chirální separace v kapilární elektroforéze II
Müllerová, Kateřina ; Jáč, Pavel (vedoucí práce) ; Lochman, Lukáš (oponent)
Katedra: Katedra analytické chemie Kandidát: Kateřina Műllerová Školitel: PharmDr. Pavel Jáč, Ph.D Název diplomové práce: Testování potenciálního využití chirálních iontových kapalin s dlouhým řetězcem pro chirální separace v kapilární elektroforéze II Chirální iontová kapalina (−)-N-dodecyl-N-methylephedrinium bromid (DMEB) byla testována jako selektor pro chirální separace vybraných léčiv (chinolonová antibiotika, ketoprofen a flurbiprofen) pomocí kapilární elektroforézy (CE). Byl zkoumán vliv několika parametrů na enantioseparaci: (i) typ a pH pufru, (ii) typ a množství organického modifikátoru a (iii) koncentrace DMEB. Při použití tohoto chirálního selektoru byla pozorována enantioseparace pouze u ofloxacinu, u zbylých chirálních léčiv separace za daných podmínek neproběhla. Jako další krok byla vyvinuta CE metoda pro stanovení levofloxacinu, aby bylo možné předvést potenciál DMEB jako chirálního selektoru v kontrole kvality chirálně čistých léčiv. Nejlepší separace bylo dosaženo se základním elektrolytem o složení: 20mM trizmový pufr o pH 8,5 se 100 mM DMEB a 20 % (v/v) acetonitrilu. Separace probíhala v křemenné kapiláře (80,5 cm / 72 cm) s vnitřním průměrem 50 µm při −30 kV s UV detekcí při 291 nm. Rozlišení mezi píky S- a R-ofloxacinu bylo 4,22 ± 0,02 (n = 3). Linearita metody byla...
|
|
|
Chirální separace klastrových sloučenin boru
Linková, Kristýna ; Kučera, Radim (vedoucí práce) ; Lochman, Lukáš (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Kandidát: Kristýna Linková Vedoucí diplomové práce: doc. PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. Konzultant: Mgr. Ondřej Horáček Název diplomové práce: Chirální separace klastrových sloučenin boru Atom boru má schopnost vytvářet tzv. elektron deficitní vazby, kdy se tří vazeb účastní pouze dva elektrony. Tato výrazná delokalizace elektronů nad třístředovou vazbou je pak zodpovědná za vznik trojrozměrných klastrů. Klastrové sloučeniny boru mají abiotický charakter a vyznačují se specifickými vlastnostmi, např. tepelnou a metabolickou stabilitou, vysokou lipofilitou a delokalizovaným negativním nábojem. V oblasti medicinální chemie jsou zkoumány jako vhodné izostery fenylové skupiny. Byly u nich pozorovány např. protirakovinná aktivita, schopnost inhibice HIV-proteáz a antirevmatoidní aktivita. Je nutné zmínit také jejich využití v záchytné neutronové terapii při léčbě nádorových onemocnění. Některé klastrové sloučeniny boru zkoumané jako nová potenciální léčiva jsou ale chirální, a proto je nezbytné k dalšímu rozšíření jejich použití ve farmacii a medicíně získat enantiomerně čisté látky. Dosavadní práce zaměřené na chirální separace boranových klastrů v naší vědecké skupině, byly provedeny...
|
|
|
Sledování oxidačního stresu HPLC metodami
Kalíšková, Tereza ; Váňová, Nela (vedoucí práce) ; Lochman, Lukáš (oponent)
Reaktivní formy kyslíku a dusíku mají v organismech svou fyziologickou úlohu, ale jejich nadměrná tvorba poškozuje buňky a může vyústit v řadu onemocnění. Interakcí reaktivních forem kyslíku a dusíku s biomolekulami dochází k jejich poškození. Poškozené molekuly lipidů, proteinu i DNA poté slouží jako biomarkery oxidačního stresu a umožňují jeho hodnocení. Oxidační stres může být vyvolán také vnějšími faktory například léčivy, ten se poté může projevit jako nežádoucí a toxické účinky. Pro sledování bezpečnosti léčiv je tedy důležité sledovat schopnost léčiva vyvolat oxidační stres. Pro stanovení malondialdehydu z buněčné pelety jako biomarkeru lipoperoxidace byla vyvinuta metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometii. Největší pozornost byla věnována optimalizaci úpravy vzorku pomocí deproteinace, derivatizace a extrakce na tuhou fázi. Metoda byla validována s přijatelnou specifitou, přesností, precizností výtěžnosti i matricovými efekty a vyhovuje tak požadavkům Evropské lékové agentury na validaci bioanalytických metod. Metodou lze stanovit intracelulární malondialdehyd v rozmezí koncentrací 0,1-2 μmol∙dm-3. Metoda byla úspěšně použita na analýzu biologických vzorků z in vitro experimentu, kde bylo hodnoceno množství malondialdehydu v HepG2 buňkách...
|
|
|
Studium rozpoznávacích částí senzorických azaftalocyaninů
Lochman, Lukáš ; Nováková, Veronika (vedoucí práce) ; Musílek, Kamil (oponent) ; Kubát, Pavel (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Kandidát: Mgr. Lukáš Lochman Školitel: Doc. PharmDr. Veronika Nováková, Ph.D. Konzultant: Doc. PharmDr. Petr Zimčík, Ph.D. Disertační práce: Studium rozpoznávacích částí senzorických azaftalocyaninů Azaftalocyaniny (AzaPc) jsou planární makrocyklické látky s unikátními fotofyzikálními vlastnostmi, jako jsou absorpce a emise nad 650 nm a vysoké kvantové výtěžky fluorescence. U alkylamino substituovaných AzaPc byl objeven jev zvaný intramolekulární přenos náboje (ICT), který je zodpovědný za účinné zhášení excitovaných stavů (nefluorescentní OFF stav). ICT probíhá mezi donorem (periferní amin) a akceptorem (makrocyklické jádro). Pokud zablokujeme probíhající ICT, dojde k obnovení kompetitivní relaxační cesty formou silné emise fluorescence (fluorescentní ON stav). ICT v AzaPc lze blokovat dvěma způsoby: Protonizací donoru, kterého se využívá u pH-senzitivních AzaPc senzorů, nebo koordinací kationtu kovu do rozpoznávací části typické pro AzaPc senzory citlivé ke kationtům kovu. Výše zmíněné vlastnosti předurčují AzaPc, aby se staly novými fluorescenčními senzory s dobrou svítivostí a výhodnou absorpcí a emisí červeného světla, které může pronikat hluboko do tkání díky nízké...
|
host ::
RSS.