|
Molekulární mechanizmy a morfologické změny související s fertilizační schopností spermie myši.
Šebková, Nataša ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Jonáková, Věra (oponent) ; Linhart, Otomar (oponent)
Proces kapacitace a akrozomální reakce (AR) spermie jsou velmi dynamické děje nezbytné pro oplození, kterých se účastní mimo jiné i cytoskeletální proteiny v hlavičce spermie. Studium distribuce aktinu, spektrinu a α-tubulinu v hlavičce zástupců savčích spermií ukázala, že před a po AR dochází ke změnám v distribuci cytoskeletálních struktur v hlavičkách spermií všech zástupců a to zejména v apikální části akrozómu, ale také v ekvatoriální a postakrozomální oblasti hlavičky spermie. Zejména dobře prostudovaný aktinový cytoskelet hraje důležitou úlohu jak v průběhu kapacitace, tak před i po AR Estrogeny vnějšího prostředí mohou interferovat s funkcí endogenních hormonů i ve velmi nízkých koncentracích. Mohou iniciovat interakce se specifickými receptory a tím ovlivňovat signální dráhy vedoucí ke kapacitaci a AR spermií. Účinek 17β-estradiolu, estronu, estriolu a 17α-ethynylestadiolu byl hodnocen podle míry tyrozinové fosforylace a stavu akrozómu během in vitro kapacitace v hlavičce spermie. Ukázalo se, že estrogeny výrazně stimulují proces kapacitace v závislosti na jejich koncentraci. Estrogeny také snižují počet spermií, které procházejí indukovanou AR. Zvýšení koncentrace estrogenů v přírodním prostředí může představovat potenciální riziko ve změnách mechanizmů vedoucích ke schopnosti spermií...
|
|
Protein tau se kooperativně sdružuje do kohezních obálek, které chrání mikrotubuly před štěpícími enzymy
Siahaan, Valerie ; Braun, Marcus (vedoucí práce) ; Middelkoop, Teije Corneel (oponent) ; Piliarik, Marek (oponent)
Tau protein se přednostně se nachází v neuronálních axonech, navázaný na mikrotubuly. U neu- rodegenerativních onemocnění, souhrnně nazývaných tauopatie, je nesprávná funkce tau často spojována s abnormální fosforylací tau a koreluje s axonální degenerací a ztrátou celkového množství mikrotubulů (Kneynsberg et al., 2017). Tau může chránit mikrotubuly před enzymy štěpícími mikrotubuly, jako je katanin (Qiang et al., 2006) a regulovat transport molekulárními motory podél mikrotubulu (Vershinin et al., 2007; Dixit et al., 2008). Nicméně je stále nejasné, jak tau tyto regulační funkce provádí. Pomocí in vitro rekonstituce a TIRF mikroskopie jsme ukázali, že molekuly tau se mohou vázat na mikrotubuly dvěma odlišnými způsoby: buď jako (i) jednotlivé molekuly tau nezávisle difundující na povrchu mikrotubulů, nebo jako (ii) kooperativně vázané tau, které tvoří kohezivní tau "obálky" obklopující povrch mikrotubulu (Siahaan et al., 2019; Tan et al., 2019; Siahaan et al., 2022). Zjistili jsme, že tvorba tau obálky mění rozmístění tubulinových dimerů v rámci mikrotubulu, a to tak, že zhutňuje mikrotubul pod vznikající tau obálkou. Extenze mikrotubulu naopak indukuje rozložení tau obálky (Siahaan et al., 2022). Tau obálky tvoří selektivně propustnou bariéru, která inhibuje motory kinesinu-1 a zároveň umožňuje...
|
|
Výpočtové modelování mechanického chování živé buňky
Wojtek, Lukáš ; Fuis, Vladimír (oponent) ; Jadrná, Lucie (vedoucí práce)
Předkládaná diplomová práce se zabývá strukturou živočišných buněk a jejich mechanickou odezvou na zatěžování. Mechanicky významnou komponentou při tvorbě výpočtového modelu buňky je její cytoskelet. Ten se skládá z aktinových vláken, intermediárních filament a mikrotubulů. Práce se zaměřuje na zjištění tuhosti mikrotubulů a její vliv na celkovou tuhost buňky. Kvůli rozdílným vlastnostem mikrotubulů v tahu a tlaku byl nalezen efektivní modul pružnosti za využití výpočtového modelování. Vliv nově zjištěného modulu pružnosti na celkovou mechanickou odezvu buňky byl zjišťován pomocí simulace mechanické zkoušky přilnuté buňky v tlaku. Ta byla realizována pomocí hybridního výpočtového modelu buňky zahrnujícího kromě cytoskeletu i kontinua buňky – jádro, cytoplasmu a cytoplasmatickou membránu. Výsledky této práce by měly sloužit jako podklad pro další výzkum vlivu tuhosti cytoskeletu na mechanickou odezvu buňky.
|
|
Využití tensegritních struktur pro modelování mechanického chování hladkých svalových buněk
Bauer, David ; Fuis, Vladimír (oponent) ; Burša, Jiří (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá výpočtovým modelováním mechanických zkoušek hladkých svalových buněk. Hlavním cílem je vytvořit výpočtový model buňky, simulovat na něm jednoosou tahovou zkoušku a upravit model tak, aby více odpovídal reálné mechanické odezvě buňky. Model buňky zahrnuje cytoplasmu, jádro, buněčnou membránu a cytoskelet, který je modelován jako tensegritní struktura. Na modelu byla simulována tahová zkouška pro případ celé buňky a buňky s rozrušeným cytoskeletem. Křivka síla-protažení, která je získána ze simulace, je porovnána s experimentálně zjištěnými daty získanými z literatury. Při tahové zkoušce zde byly experimentálně měřeny čerstvě izolované buňky hladkého svalstva z aorty krysy, buňky z buněčné kultury a buňky, ve kterých byla po aplikování cytochalasinu D rozrušena aktiniová vlákna. Bylo zjištěno, že vliv cytoskeletu na přenos zatížení ve výpočtovém modelu byl menší než u reálné buňky, a proto byl model upraven změnou materiálových vlastností geometrie tak, aby odpovídal jednotlivým experimentálně měřeným typům buněk.
|
|
Computational Simulation of Mechanical Tests of Isolated Animal Cells
Bansod, Yogesh Deepak ; Kučera,, Ondřej (oponent) ; Florian, Zdeněk (oponent) ; Canadas, Patrick (oponent) ; Burša, Jiří (vedoucí práce)
A cell is complex biological system subjected to the myriad of extracellular mechanical stimuli. A deeper understanding of its mechanical behavior is important for the characterization of response in health and diseased conditions. Computational modeling can enhance the understanding of cell mechanics, which may contribute to establish structure-function relationships of different cell types in different states. To achieve this, two finite element (FE) bendo-tensegrity models of a cell in different states are proposed: a suspended cell model elucidating the cell’s response to global mechanical loads, such as elongation and compression and an adherent cell model explicating the cell’s response to local mechanical load, such as indentation using atomic force microscopy (AFM). They keep the central principles of tensegrity such as prestress and interplay between components, but the elements are free to move independently of each other. Implementing the recently proposed bendo-tensegrity concept, these models take into account flexural (buckling) as well as tensional behavior of microtubules (MTs) and also incorporate the waviness of intermediate filaments (IFs). The models assume that individual cytoskeletal components can change form and organization without collapsing the entire cell structure when they are removed and thus, can evaluate the mechanical contribution of individual cytoskeletal components to the cell mechanics. The suspended cell model mimics realistically the force-elongation response during cell stretching and the force-deformation response during cell compression, and both responses illustrate a non-linear increase in stiffness with mechanical loads. The simulation results demonstrate that actin filaments (AFs) and MTs both play a crucial role in defining the tensile response of cell, whereas AFs contribute substantially to the compressive response of cell. For adherent cell model, the force-indentation responses at two distinct locations are in accordance with the non-linear behavior of AFM experimental data. The simulation results exhibit that the indentation site dominates the cell behavior and for cell rigidity actin cortex (AC), MTs, and cytoplasm are essential. The proposed models provide valuable insights into the interdependence of cellular mechanical properties, the mechanical role of cytoskeletal components individually and synergistically, and the nucleus deformation under different mechanical loading conditions. Therefore, this thesis contributes to the better understanding of the cytoskeletal mechanics, responsible for cell behavior, which in turn may aid in investigation of various pathological conditions like cancer and vascular diseases.
|
|
Role cytoskeletu v buněčné chiralitě
Jandjuková, Anna ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Soukup, Vladimír (oponent)
Cytoskelet je jednou z klíčových struktur uvnitř buňky. Mezi cytoskelet se řadí mikrofilamenta, mikrotubuly, intermediální filamenta a nově i septiny. Cytoskeletální sítě zajišťují vnitrobuněčný transport, buněčný pohyb, buněčné dělení a oporu buňky. Chirální objekt je takový, který není totožný se svým zrcadlovým obrazem. Pojem chiralita se nejčastěji používá k popisu chemických molekul. Buňky živých organismů jsou tvořeny molekulami, které jsou většinou chirální. V posledních letech byla pozorována buněčná chiralita, na které se nejspíš cytoskelet podílí. Chiralitou buňky se rozumí tvar buňky, pozice organel, ustálený pohyb buněk a směřovaný růst buněčné kultury. Nejnovější poznatky poukazují na pravděpodobný vliv chirality buňky na vznik pravo-levé asymetrie tělního plánu v průběhu embryonálního vývoje živočichů. Práce shrnuje dosavadní poznatky týkající se role cytoskeletu v ustanovení buněčné chirality a pravděpodobné souvislosti se vznikem pravo-levé asymetrie v průběhu embryonálního vývoje. Klíčová slova Chiralita buňky, cytoskelet, embryonální vývoj
|
|
Savčí septiny v buněčných procesech
Hrbáč, Patrik ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Zelená, Marie (oponent)
Septiny jsou cytoskeletární GTP vazebné proteiny s unikátními vlastnostmi. Vyskytují se od jednobuněčných eukaryot až po savce s výjimkou vyšších rostlin. Napříč organismy mají septiny dobře konzervovanou strukturu i funkci. V buňkách jsou septiny lokalizovány v cytoplazmě, kde jsou schopné tvořit filamenta a struktury vyššího řádu. Mimoto interagují s buněčnými membránami, aktinovými filamenty, mikrotubuly a množstvím různorodých proteinů. Změny v expresi septinů se často projeví poruchami rozličných buněčných procesů a jsou tak spjaty s různými nemocemi. Kvůli tomu se nabízí pro savčí septiny možnost klinického využití. Se stále rostoucím počtem rolí v buňce se septinům dostává nemalé pozornosti a poznatky o nich rostou závratným tempem. V této rešerši se pokusím shrnout co největší množství informací o struktuře, skladbě, funkci a praktickém využití savčích septinů.
|
|
Intermediate filaments in mammalian cell motility
Čermáková, Kateřina ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Pelantová, Markéta (oponent)
Buněčná migrace hraje klíčovou roli ve formování a udržování mnohobuněčného savčího těla. Podílí se na tak zásadních jevech, jakými jsou embryonální vývoj, obnova tkání nebo imunitní odpověď. Jedná se o komplexní děj, zahrnující celou škálu procesů, včetně příslušné signalisace. Narušení těchto procesů se může manifestovat širokou škálou patologických stavů, od narušeného hojení ran až po nádorovou invasivitu, proto jsou děje provázející migraci cílem výzkumu mnoha týmů. Migrace buněk je závislá na cytoskeletu, který je v migrujících buňkách zásadně přestavován a neustále přizpůsobován pohybu. Tato práce si klade za cíl shrnout poznatky o úloze středních filament v migraci savčích buněk. Jedná se o nejméně probádaný cytoskeletární systém v tomto kontextu. Cytoplasmatická i jaderná střední filamenta, díky svým unikátním mechanoelastickým vlastnostem, významně ovlivňují mechaniku buňky. Poskytují jí fyzickou ochranu před silami, působícími při migraci skrze stísněné prostory komplexního mezibuněčného prostředí. Zároveň ovlivňují a usměrňují kontraktilitu aktomyosinové sítě, jež je hnacím motorem buněčného pohybu, a dále se podílí na zásadních krocích migrace, jakými jsou polarisace, přichycení buněk k okolním povrchům nebo navigace skrze spletité extracelulární prostředí.
|
|
Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) proteiny: Spojník tetraspaninových sítí a cytoskeletu gamet
Picková, Jana ; Frolíková, Michaela (vedoucí práce) ; Lánská, Eva (oponent)
Ezrin, který společně s radixinem a moesinem patří do rodiny ERM proteinů, hraje významnou roli v propojení membránových proteinů s aktinovým cytoskeletem. Ve spermiích byl ezrin doposud identifikován pouze u lidí a býků, kde se pravděpodobně podílí na řízení polymerace aktinu během kapacitace. V průběhu akrozomální reakce hraje aktin důležitou roli v přesunu proteinů z vnitřní akrozomální membrány do ekvatoriálního segmentu, což je děj nezbytný pro úspěšný průběh oplození. Mezi proteiny, které se během akrozomální reakce přesouvají do ekvatoriálního segmentu, místa iniciace fúze gamet, patří i protein CD9. Tento protein pravděpodobně stabilizuje interakce ostatních proteinů mezi spermií a oocytem během fúze gamet. V této diplomové práci jsme se zaměřili na roli ezrinu v propojení proteinu CD9 s aktinovým cytoskeletem v myší spermii. Pomocí nepřímé imunofluorescence jsme detekovali přítomnost ezrinu, CD9 a aktinu v akrozom intaktní myší spermii. Jejich ko-lokalizace v apikální akrozomální oblasti spermie naznačuje, že tyto proteiny mohou ve spermii interagovat, avšak naše výsledky ko-imunoprecipitace tuto možnost nepotvrdili. Nicméně, v apikální akrozomální oblasti jsme detekovali také přítomnost proteinu EWI-2, který by mohl být prostředníkem této vazby. V rámci práce jsme se rovněž zabývali...
|
|
The role of anillin in the growth cone of neurons
Tomášová, Štěpánka ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Vinopal, Stanislav (oponent)
Axony nově vznikajících neuronů se musí během embryonálního vývoje správně propojit, aby vytvořily fungující neurální síť. Pro tento účel slouží růstový kónus, vysoce dynamická struktura na konci rostoucích axonů, která zajišťuje navigaci i samotný pohyb. Pro správné hledání cesty je nutná komunikace mezi aktinem a mikrotubuly. Přesný mechanismus takové kooperace však dosud není objasněn. Tato diplomová práce studuje možnou roli proteinu anillinu v tomto procesu. Anillin byl studován ve dvou lidských buněčných liních. V SH-SY5Y neuroblastomové linii byla provedena transgenní overexprese a siRNA knock-down. Zvýšení exprese anillinu v SH-SY5Y buňkách vedlo k vzniku poškozených neuritů, zatímco buňky se sníženou expresí tvořily méně neuritů. Dále byly studovány neurony diferencované z lidských iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky), ve kterých se exprimuje endogenní fluorescenčně značený anillin. Zde byly pozorovány lokální dynamické shluky anillinu na bázi dynamických výběžků diferencujících se neuronů. Shluky se objevovaly zejména během migrace, iniciace nových neuritů, ale také v čerstvě vzniklých růstových kónech. Tyto výsledky nasvědčují tomu, že anillin hraje roli v zakládání neuritů lidských neuronů. Pro odhalení přesné funkce anillinu v těchto buňkách bude třeba další práce.
|