|
|
Genová exprese v kuřecím embryu: mikromanipulační a vizualizační metody
Bendová, Michaela
Cílem této dizertační práce bylo získat lepší vhled do principů vývoje buněčných struktur a orgánů v kuřecím embryu. K tomuto účelu byly zavedeny a k daným procedurám upraveny různé pokročilé metody manipulace a vizualizace in vitro, ex vivo, ex ovo a in ovo. Tyto specializované metody byly využity zejména ke studiu genové exprese ve vývoji neurální lišty a vývoji oka. Během dlouhodobého výzkumu v naší laboratoři byl pozorován vliv onkoproteinu v-Myb na vývoj neurální lišty a jeho schopnost měnit přirozený buněčný osud. Studovali jsme vliv proteinu v-Myb na změny v diferenciaci buněk neurální lišty, zejména jejich vývoj do melanocytární linie, a jeho vliv na expresi genů v neurální liště. Středem našeho zájmu se stal protein Gremlin 2, označovaný také jako PRDC (protein related to Dan and Cerberus), jehož expresi v-Myb v neurální liště zvyšuje. Zavedené postupy elektroporace neurální lišty in ovo byly upraveny pro transfekci buněk vyvíjejícího se oka a využity ke studiu genové regulace při indukci čočky. Výsledky získané na kuřecím modelu podpořily studii provedenou na myších embryích. Technika elektroporace do embryonálního oka byla také upravena pro mikromanipulace s retinou in ovo, která byla dále zpracována metodami ex vivo a in vitro pro studii zabývající se lokalizací snRNP ve...
|
|
|
Regeneration initiation of Xenopus laevis tail-functional study
Netušil, Jiří ; Šindelka, Radek (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Přelomové objevy na poli sekvenačních technologií mění naše momentální vnímání regenerace obratlovců. Embryonální stádia Drápatky vodní (Xenopus laevis) jsou v tomto kontextu jedním z intenzivně studovaných modelů. Tato práce má za cíl shrnout a funkčně ověřit nejnovější poznatky získané pomocí RNA sekvenační analýzy regenerujícího se ocasu Xenopus laevis se specifickým zaměřením na časné fáze tohoto procesu. Naše analýza potvrdila, že Regeneration initiating cells (RICs), které byly v nedávné době identifikovány pomocí jednobuněčného sekvenování a prostorově rozlišené transkriptomiky, jsou nezbytné pro správný průběh regenerace ocasu. Markerové geny RIC mmp9 a pmepa1 ovlivňují procesy spojené s přestavbou extracelulární matrix a migrací již dříve popsaných Regeneration organizing cells (ROCs) aniž by ovlivňovaly odpověď myeloidních buněk na poranění. V rámci této práce jsme také ukázali nové použití Vivo Morpholino oligonukleotidů pro dočasnou inhibici genové exprese a posoudili jeho přednosti a limitace. Tato práce poukazuje na důležitost prostorovo-časové regulace na buněčné a molekulární úrovni, která se odehrává v rámci prvních 24 hodin po poranění. Dále zdůrazňuje podobnosti a odlišnosti těchto změn v rámci různých modelů regenerace obratlovců a celkově poskytuje ucelený vhled do problematiky...
|
|
|
Rypoš lysý a myš domácí jako modelové organismy reprodukčního stárnutí
KOPECKÁ, Eva
The aim of this study is to demonstrate the naked mole rat as a new possible model of reproductive aging. It is also pointing out the reproductive problems and diseases associated with increasing age in women. Furthermore, the study wants to introduce the role of mTOR in mouse embryonic development in relation to maternal age and decrease in fertility in a view of number of oocytes in mouse, guinea pig and naked mole rat.
|
|
|
The foundation of maternal factors in sturgeon: from oocyte to embryo
POCHERNIAIEVA, Kseniia Kostyantynivna
Pokles početnosti divokých populací jesetera v posledních desetiletích vedl k rostoucímu zájmu o využití různých biotechnologických postupů vedoucích k ochraně nebo obnově těchto ohrožených druhů. Produkce chimér, transplantace zárodečných buněk nebo produkce pomocí tzv. "náhradního rodiče" by mohly rozšířit spektrum technik používaných k záchraně druhu či vést k obnově rybích populací. Úspěšná aplikace těchto metod u jeseterů vyžaduje znalost jeho embryonálního vývoje a informace o struktuře a charakteristikách samotného jeseteřího oocytu. K odhalení intracelulární geometrie, morfogenetických aspektů, mechanismů organizace mateřských determinantů a jejich pozdější reorganizace byly v rámci této práce použity techniky qPCR tomografie, inhibice transkripce a vizualizace jader. qPCR tomografie se ukázala jako spolehlivá technika pro stanovení úlohy genů detekovaných v animalní a vegetativní hemisféře oocytů jesetera a také pro identifikaci profilů těchto genů u ranných vývojových stádií embryí jesetera. qPCR tomografie byla v zásadě provedena ve dvou krocích: předběžné kroky tomografie a samotná RT-PCR. Optimálně orientované oocyty byly rozřezány na 30 ?m a sekce (prokrývající jak animalní tak vegetativní pól), u který byla následně provedena celková extrakce RNA. 12 vybraných maternálních genů: [actb, ppia, alas1, sdha, ywhae, dnd, vasa, vegt, wnt11, ddx25, otx1 a gdf1] bylo sledováno pomocí RT-PCR. Identifikovány byly dvě skupiny transkriptů klasifikovaných jako animalní nebo vegetativní geny s jasným gradientem. Primární geny zárodečné plasmy - markery jako dnd, vasa, ddx25 byly lokalizovány směrem k vegetativnímu pólu. To vysvětluje, kde presně se nachází prapohlavní zárodečné buňky v oocytech jesetera malého. Dalším aspektem použití této techniky byla srovnávací analýza profilů RNA v oocytech drápatky Xenopus laevis a jesetera malého Acipenser ruthenus. Byla zjištěna jednoznačná podobnost v lokalizaci molekul mRNA u těchto dvou druhů. Takovéto podobnosti v expresních profilech vzdáleně příbuzných druhů naznačují, že jejich dávní předkové mohli vzniknout z více příbuzných linií. alpha-Amanitin jako transkripční inhibiční faktor byl použit ke stanovení zygotického genomového přechodu v embryích jesetera malého. Přechod z mateřského na zygotický typ transkripce je charakterizován eliminací mateřských transkriptů a pokračuje produkcí zygotických transkriptů. U jesetera malého byl tento přechod identifikován po desátém štěpení - během pozdní blastuly, kdy počet buněk v blastomeře překročil 1000. Morfologické změny během přechodu mid-blastuly představují milníky ve vývoji metazoanů, protože každá buňka přenáší perfektní kopii svého genomu v každé divizi. Embrya vzniklá křížením jiker jesetera malého A. ruthenus a spermatu jesetera ruského Acipenser gueldenstaedtii druhů s odlišnou ploidní úrovní byla vytvořena za účelem zvýšení obsahu DNA v jádrech buněk. Nukleární vizualizace barvením 4'-6-diaminido-2-fenylindolem (DAPI) ukázala, že se buňky dělí synchronně konstantní rychlostí až do MBT v devátém buněčném cyklu u kontrolních embryí, která odpovídají 1000 buněčnému stadiu (13 hpf). Hybridní embrya jesetera malého a ruského vykazovala přechod od synchronního k asynchronnímu dělení v osmém buněčném cyklu, což je stadium 512 buněk (12 hpf). U jesetera malého i hybridních embryí došlo k přechodu během 1 hodiny. Embrya jesetera injikovaného alpha-Amanitinem také vykazovala kinetiku buněčného cyklu podobnou kontrolám, a to bez zpoždění nebo malformace během štěpení, což s největší pravděpodobností naznačuje, že MBT u jesetera probíhá nezávisle na začátku produkce zygotických transkriptů.
|
|
|
The role of microRNAs in regulation of mammalian oocyte and embryo development
Marcollová, Kateřina ; Procházka, Radek (vedoucí práce) ; Svoboda, Petr (oponent)
Komplex kumulárních buněk a oocytu je nezbytný pro savčí reprodukci. Kumulární buňky pouze nevyživují oocyt, ale take představují důležitý komunikační bod pro předávání informací k a od oocytu. Nekódující miRNAs jsou schopny regulavat posttranskripční události a díky tomu mohou posloužit jako vhodný biomarker pro hodnocení stavu buněk. Na základě barvení COCs pomocí vitalní barvičky Lissamine Green B jsme kumulární buňky rozdělelili na více a méně kvalitní skupinu. Navíc jsme začlenili rozdělení podle GV a MII vývojového stadia. Analýza sekvenačních dat neukázala signifikantní rozdíly v DE miRNA z kvalitativně rozdílných stádií. Nicméně, rozdíly v DE miRNA byly detekovány mezi dvěma vývojově rozdílnými stádii. Identifikovali jsme např. ssc-miR-183, ssc-miR-182, a ssc-miR-21-5p jako značně downregulované v porovnání GV a MII stadia. Členové let-7 rodiny (let-7c, let-7a, let- 7f-5p), ssc-miR-16, ssc-miR-21-5p a ssc-miR-125a patřily k nejvíce exprimovaným miRNA ve všech vzorcích. Geny, ke kterým se vztahovaly DE miRNA se týkaly především ErbB, TGF-β, MAPK, FoxO, gap junction a cGMP signálních drah. Usuzujeme, že jednotlivé miRNA v kumulárních buňkách pravděpodobně nemohou sloužit jako spolehlivý indikátor kvality oocytu. Na druhé straně, změny v expresi miRNA v kumulárních buňkách během zrání COCs by...
|
|
|
Lokalizace maternálních RNA ve vajíčcích a časných embryích
Šimková, Kateřina ; Šindelka, Radek (vedoucí práce) ; Frolíková, Michaela (oponent)
Určení stavby tělního plánu díky asymetrickému rozložení maternálních RNA a proteinů bylo studováno u mnoha živočišných druhů. Během oogeneze si živočichové vytváří zásoby těchto RNA a proteinů, které využívají pro regulaci embryonálního vývoje, a to až do znovuzahájení transkripce z embryonálního genomu. V této diplomové práci jsem se věnovala především identifikaci asymetricky rozmístěných RNA v časných embryích obojživelníka Ambystoma mexicanum, které stojí za určením animálně-vegetativní osy. V druhé části mé práce jsem se také pokusila identifikovat asymetricky rozmístěné RNA ve 2 a 4 buněčném embryu, které by mohly stát za určením dalších tělních os - dorzo-ventrální a levo-pravé. Pomocí RT-qPCR tomografie se mi úspěšně podařilo stanovit lokalizační profil vybraných maternálních RNA podél A-V osy a v jednotlivých blastomerách 2 a 4 buněčného embrya. Dále se nám pomocí RNA-seq podařilo získat celkový obraz transkriptomu časných embryí, který nám ukázal, že se během časného vývoje odehrává řada změn. Tyto události jsem rozdělila do tří kategorií: relokalizace RNA, syntéza RNA před aktivací embryonální transkripce a degradace RNA v časném vývoji. Zajímavé zjištění bylo odhaleno ve skupině RNA degradovaných během časného vývoje, která obsahuje řadu genů, které mají u Xenopus laevis a dalších...
|
|
|
Non-coding RNAs in oocyte and early embryo
Aleshkina, Daria ; Šušor, Andrej (vedoucí práce) ; Staněk, David (oponent) ; Krylov, Vladimír (oponent)
(česky) Nekódující RNA (ncRNA), které byly dříve považovány za ‚transkripční šum', jsou dnes známé jako klíčové molekuly v hlavních buněčných procesech. NcRNA jsou exprimovány ve vysokých hladinách - pouze 2 % transkribovaného genomu u vyšších eukaryot odpovídá proteinům kódujícím RNA. Je známo, že řada různých ncRNA má strukturní, funkční či regulační role, ale vliv většiny nekódujících transkriptů zůstává nejasný. Mezi ncRNA jsou obzvláště zajímavé dlouhé ncRNA (lncRNAs, delší než 200 bp). LncRNA nemají jednotnou funkci, ale v mnoha studiích byly pozorovány regulace na transkripční a translační úrovni, které jsou založené na regulaci lncRNA. Proto by nové lncRNA mohly pomoct vylepšit syntézu proteinů ve vysoce diferencovaných buněčných typech. Zejména plně dorostlý savčí oocyt a rané embryo vyžadují přesně kontrolovanou translaci maternálních transkriptů k tomu, aby mohla být koordinována meiotická progrese a časný vývoj embrya, zatímco je transkripce umlčena. Zaměřili jsme se tedy na studium zapojení ncRNA do syntézy proteinů a následného vlivu na fyziologii oocytu a raného embrya. Nejdříve jsme analyzovali expresi a distribuci několika ncRNA během meiotického zrání a časného vývoje embrya - jmenovitě BC1 (Brain cytoplasmic RNA 1), Rose (lncRNA in Oocyte Specific Expressed), Rn7sk (RNA Component...
|
|
|
Faktory ovlivňující vývoj parthenogenetických embryí myši
Jettmarová, Dominika ; Fulka, Josef (vedoucí práce) ; Kaňka, Jiří (oponent)
Vývoj haploidních parthenogenetických embryí myši (Mus musculus) nedosahuje stejné úrovně jako je tomu u normálních embryí. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, zda se haploidní parthenogenetická embrya myši odlišují nukleocytoplasmatickým poměrem. Objem jádra parthenogenetických embryí roste s ploiditou. Nukleocytoplasmatický poměr haploidních embryí se mezi dvoubuněčným a čtyřbuněčným stádiem statisticky neliší (p = 0.052), u diploidních a tetraploidních embryí byl naopak statisticky významný rozdíl (p < 0.001). Nestandardní nukleocytoplasmatický poměr by mohl souviset s problematickým vývojem. Pochopení faktorů ovlivňujících preimplantační vývoj parthenogenetických embryí zvýší efektivitu derivace haploidních embryonálních kmenových buněk.
|
|
|
Genová exprese v kuřecím embryu: mikromanipulační a vizualizační metody
Bendová, Michaela ; Dvořák, Michal (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Cílem této dizertační práce bylo získat lepší vhled do principů vývoje buněčných struktur a orgánů v kuřecím embryu. K tomuto účelu byly zavedeny a k daným procedurám upraveny různé pokročilé metody manipulace a vizualizace in vitro, ex vivo, ex ovo a in ovo. Tyto specializované metody byly využity zejména ke studiu genové exprese ve vývoji neurální lišty a vývoji oka. Během dlouhodobého výzkumu v naší laboratoři byl pozorován vliv onkoproteinu v-Myb na vývoj neurální lišty a jeho schopnost měnit přirozený buněčný osud. Studovali jsme vliv proteinu v-Myb na změny v diferenciaci buněk neurální lišty, zejména jejich vývoj do melanocytární linie, a jeho vliv na expresi genů v neurální liště. Středem našeho zájmu se stal protein Gremlin 2, označovaný také jako PRDC (protein related to Dan and Cerberus), jehož expresi v-Myb v neurální liště zvyšuje. Zavedené postupy elektroporace neurální lišty in ovo byly upraveny pro transfekci buněk vyvíjejícího se oka a využity ke studiu genové regulace při indukci čočky. Výsledky získané na kuřecím modelu podpořily studii provedenou na myších embryích. Technika elektroporace do embryonálního oka byla také upravena pro mikromanipulace s retinou in ovo, která byla dále zpracována metodami ex vivo a in vitro pro studii zabývající se lokalizací snRNP ve...
|
|
|
Role of Nkx2.5 in development and electrophysiology of the mouse heart
Hámor, Peter ; Sedmera, David (vedoucí práce) ; Neckář, Jan (oponent)
Role genu Nkx2.5 v morfogenezi a elektrofyziologii srdce u myši Praha 2016 Bc. Peter Hámor ABSTRAKT Cieľom tejto práce je skúmanie vplyvu dávkovania génu Nkx2.5 na elektrofyziológiu srdca myší v prenatálnom období vývoja. Hlavnou úlohou je hľadanie rozdielov vo vedení elektrického vzruchu v srdci myších embryí v závislosti na ich genotype. Bola na to použitá špecifická metóda snímania prechodu elektrického vzruchu myokardom, tzv. optické mapovanie. Vďaka tejto metóde bolo možné vytvoriť obrázky a videá zachytávajúce prechod elektrického impulzu srdcom, s označením začiatku a smerovania jeho vedenia. Z výstupov týchto snímaní, tzv. optických máp, sú určené prípadné anomálie a výchylky v porovnaní s normálnou funkciou srdca. Práca sa zameriava na expresiu transkripčného faktoru Nkx2.5 a s ním súvisiacich regulačných prvkov, ktoré sa podieľajú na správnom formovaní a fyziológii srdca do obdobia vývoja približne 9,5 dní post coitum (d.p.c.). Jedinci v tomto vývojovom štádiu boli opticky mapovaní a porovnávaní na základe ich genotypu - homozygotne nemutantné, heterozygotné a homozygotne mutantné myšie embryá vykazovali určité podobné vlastnosti, kým v niektorých sa dramaticky líšili. Keďže táto práca je jedna z mála, ktorá detailne skúma optické mapy homozygotne mutantných jedincov v géne Nkx2.5, výsledky z nej...
|
host ::
RSS.