|
|
Analýza regulačních oblastí genů v genomu oxymonády Monocercomonoides
Brzoň, Ondřej ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
iii Abstrakt Regulace genové exprese je klíčovou schopností každé buňky v jejím vývoji, diferenciaci a v udržování homeostázy. Prozatím je ale dostupných poměrně málo informací o regulaci genové exprese u prvoků a naše poznatky o tomto procesu u eukaryot pocházejí pouze z několika modelových organismů. Náš výzkum probíhá na oxymonádách, skupině málo prozkoumaných anaerobních protist, vyskytujících se ve střevech některých živočichů. V této práci se zabýváme rodem Monocercomonoides. Genová exprese je ovlivňována mnoha mechanismy na několika úrovních. My jsme se zaměřili na strukturu promotorových oblastí, 5' nepřekládané oblasti a základní transkripční a translační iniciační faktory. Naše výsledky srovnáváme s nejbližšími prozkoumanými příbuznými rodu Monocercomonoides, kterými jsou Trichomonas vaginalis a Giardia intestinalis. V promotorových oblastech Monocercomonoides jsme identifikovali několik konzervovaných motivů, které se potenciálně podílí na regulaci transkripce, včetně TATA boxu a TATA-like motivu. 5' nepřekládané oblasti jsou poměrně krátké (většinou 20 - 30 nukleotidů) a obsah GC párů v těchto oblastech je nižší, než je obvyklé u modelových organismů. U vybraných genů jsme délky těchto oblastí ověřovali pomocí RACE. V genomu Monocercomonoides jsme anotovali sady základních transkripčních (23...
|
|
|
Objasnění vlivu proteinkináz ERK1 a ERK2 na iniciaci translace nezávislé na čepičce
Přibyl, Miroslav ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Proteinkinázy ERK1 a ERK2 jsou jedny z nejstudovanějších proteinů buněčné signalizace. Oba proteiny se podílejí na velkém množství procesů ať už fosforylací proteinových substrátů nebo aktivací proteinkináz, které jsou součástí dalších signálních drah. Enzymy ERK1 a ERK2 jsou součástí MAPK/ERK signální kaskády, která je spojována s mnoha buněčnými ději, jakými jsou například buněčná proliferace, buněčný růst nebo diferenciace. Signální kaskáda MAPK/ERK je často silně aktivována v různých typech rakovinných bujení a je jedním z cílů vývoje nízkomolekulárních inhibitorů v léčbě nádorových onemocnění. Jednou z hlavních otázek základního výzkumu proteinů ERK1 a ERK2 je rozdílnost obou proteinkináz. Přestože mnohé poznatky poukazují na redundanci těchto proteinů, objevují se i poznatky tvrdící opak. Nedávná publikace skupiny Casanova et al. 2012 nepřímo poukazuje na rozdílný vliv proteinkináz ERK1 a ERK2 na iniciaci translace, která není závislá na čepičce, nýbrž na vnitřním vazebném místě pro ribozom, IRES. V Laboratoři biochemie RNA se už dlouho zabýváme iniciací translace zprostředkovanou HCV IRES (z ang. Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site, Vnitřní vazebné místo pro ribozomu viru žloutenky typu C). Tato diplomová práce vedla k zavedení metody RNA interference v naší laboratoři a vytvoření...
|
|
|
Design siRNA a vliv modifikací na jejich stabilitu a účinnost
Kuldanová, Kateřina ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Návrh krátkých interferujících RNA (siRNA) je základním krokem k úspěšné RNA interferenci (RNAi). Navrhnout vhodný siRNA duplex ale není zcela triviální, neboť existuje několik problematických oblastí, jako jsou například stabilita siRNA duplexů v přítomnosti nukleáz, účinnost eliminace cílové mRNA, sekvenčně specifická eliminace necílových mRNA, cytotoxicita a imunogenicita, ovlivňujících funkčnost siRNA duplexů a tedy i jejich využitelnost v medicíně a dalších oborech. Porozumění principům fungování siRNA duplexů při RNAi je nezbytným krokem k vyřešení výše uvedených překážek na cestě k účinným léčivům. Prostředkem optimalizace popsaných vlastností je úprava návrhu siRNA duplexů pomocí různých modifikací. Modifikovat lze fosfodiesterovou kostru, báze i ribózu. V každé z těchto skupin jsou známy modifikace, které mají na siRNA duplexy a následnou RNA interferenci pozitivní vliv. Tato práce předkládá dosavadní poznatky o několika nejznámějších modifikacích, jako jsou thiofosfátová substituce, 2′-deoxy-2′-fluoronukleotidy, 2′-O-methyl ribonukleotidy a LNA nukleotidy, a o větším počtu méně známých modifikací, jako jsou boranofosfátová substituce, 4′-thioribonukleotidy, 2′-O-methyl-dithiofosfátová modifikace a mnoho dalších, které ovlivňují vlastnosti siRNA duplexu.
|
|
|
Metylace DNA u hematoonkologických onemocnění
Šeborová, Karolína ; Beličková, Monika (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Metylace DNA je jednou z nejčastějších epigenetických modifikací, při které dochází k přenosu metylové skupiny z donorové molekuly S-adenosyl-L-metioninu na 5'pozici cytosinu za vzniku 5-metylcytosinu. Tato reakce je katalyzována DNA metyltransferázami. Epigenetická modifikace hraje důležitou roli v regulaci transkripce, genomovém imprintingu, inaktivaci X-chromozómu a vývoji organismu. Právě její role v regulaci transkripce je důležitá u nádorových onemocnění. Zejména její aberantní formou, hypermetylací, může docházet k umlčení transkripce tumor supresorových genů vedoucí k progresi nádorového onemocnění. Klíčová slova: metylace DNA, demetylační léčba, hematoonkologická onemocnění, metody detekce, myelodysplastický syndrom
|
|
|
Možná úloha proteinu DAXX v zástavě buněčného cyklu a buněčné senescenci
Valášek, Ján ; Hanzlíková, Hana (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Death domain-associated protein 6 (DAXX) je multifunkčním proteinem, který se účastní rozličných buněčných procesů. Funguje jako regulátor transkripce, histonový chaperon nebo regulátor apoptózy, ve které je jeho úloha dosti kontroverzní. Účastní se také regulace odpovědi buňky na poškození DNA (DDR). Vytváří a stabilizuje komplex s Mdm2, který negativně reguluje stabilitu významného nádorového supresoru p53. Ten je součástí signalizačního uzlu v DDR. Pokud není poškození DNA pro buňku letální a současně neumožňuje pokračovat v proliferaci, dochází ke stavu nevratné zástavy buněčného cyklu, tzv. buněčné senescenci. Za fyziologických podmínek může navození senescence zabraňovat rozvoji tumorigeneze. Proto má popis mechanizmů, které se podílejí na navození senescence, potenciální klinický význam. Cílem mé diplomové práce bylo stanovit změnu množství proteinu DAXX v senescentních buňkách a charakterizovat způsob jeho regulace. V nádorových buňkách MCF-7 a primárních BJ fibroblastech jsem pozoroval snížení hladiny proteinu DAXX a regulaci jeho množství na proteinové úrovni. Otestoval jsem hypotézy, podle kterých navýšení jeho množství před poškozením DNA zabrání vstupu buňky do senescence, nebo zvýšení jeho exprese v senescenci způsobí obnovu buněčné proliferace. Obě hypotézy byly zamítnuty. Bylo by...
|
|
|
Characterization of the molecular mechanism of translation reinitiation in yeast.
Pondělíčková, Vanda ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Iniciace translace je několika stupňový proces končící sestavením 80S ribozomu umožňujícího elongaci. Při tomto procesu se musí bezchybně složit velká a malá podjednotka ribozomu, mRNA, iniciační Met-tRNAi Met a nejméně 12 eukaryotických iniciačních faktorů (eIF). Tato fáze výroby proteinů je také klíčovým místem pro regulaci genové exprese. Naše laboratoř se zaměřuje zejména na iniciační faktor eIF3, který je tvořen více proteiny a uplatňuje se ve většině fází iniciace translace. Odhalili jsme a popsali roli eIF3 v reiniciaci, genově specifickém mechanismu kontroly translace, uplatňujícím se i v regulaci exprese důležitého kvasinkového transkripčního faktoru GCN4. V této práci přináším detailní studii N-terminální domény proteinu Tif32 (podjednotka eIF3a), která umožňuje několik funkcí. Předně ukazujeme, že Tif32-NTD funkčně interaguje s 5' sekvencí krátkého předcházejícího ORF (uORF1) v GCN4 mRNA a umožňuje tak následnou účinnou reiniciaci. V 5' sekvenci uORF1 byly identifikovány čtyři elementy podporující reiniciaci (REI-promoting elements, RPEs) a dva z nich působí v součinnosti s Tif32-NTD. Struktura 5' oblasti byla počítačově modelována a následně experimentálně potvrzena. Společný strukturní motiv byl nalezen i v 5' sekvenci dalšího kvasinkového genu YAP1, který rovněž obsahuje uORF...
|
|
|
ERK1/2 MAP kináza - její strukturní charakteristika a interakční partneři
Přibyl, Miroslav ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Žíla, Vojtěch (oponent)
Mimobuněčné signální molekuly jsou rozpoznávány membránovými receptory na povrchu eukaryotických buněk. Receptory přenáší signál do vnitrobuněčného prostoru, kde dochází k aktivaci příslušných enzymů. Aktivovanými enzymy mohou být proteinkinázy, které fosforylují substrátové proteiny odpovídající potřebám pro specifické rozpoznání proteinkinázou. Substrátovými proteiny mohou být strukturní proteiny a enzymy, které dále přenáší signál nebo přímo ovlivňují fyziologické procesy buňky. Mezi proteinkinázy patří i ERK1 a ERK2 (Kináza regulovaná mimobuněčným signálem 1 a 2), enzymy které mají vliv na buněčný růst, buněčný cyklus a další řadu fyziologických procesů buňky. Proteinkináza je dynamická molekula, která během katalytického cyklu podstupuje řadu konformačních změn. Konformační změny mají vliv na stabilitu a funkci molekuly. Konzervované aminokyselinové zbytky naplňují funkci proteinkináz. Tyto faktory se zároveň podílí na interakci s proteinovými substráty a regulačními proteiny a jsou tak zodpovědné za specifickou funkci proteinkinázy.
|
|
|
Studium genové exprese faktorů signální dráhy oxysterolů u pacientek s karcinomem prsu
Kloudová, Alžběta ; Souček, Pavel (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Hormonální terapie je běžnou součástí léčby karcinomu prsu u nádorů exprimujících estrogenové a progesteronové receptory. Tato terapie má za cíl zabránit proliferativním účinkům hormonů skrze příslušné receptory a inhibovat tak růst nádoru. Část nádorů je ovšem k této terapii rezistentní navzdory expresi hormonálních receptorů, přičemž důvody této rezistence nejsou v současné době zcela objasněny. Oxysteroly jsou hydroxylované deriváty cholesterolu, které by mohly ve vzniku této rezistence hrát roli. Jejich působení může ovlivňovat účinky hormonální terapie a zároveň některé signální dráhy vedoucí k nádorové progresi. Tato práce přináší výsledky analýzy exprese genů kódujících proteiny ovlivněné působením oxysterolů, proteiny metabolismu a transportu oxysterolů, transkripční faktory a proteiny signálních drah, které mohou souviset s účinky oxysterolů v buňce. Na základě porovnání expresního profilu mezi tumory lišícími se v expresi estrogenových receptorů a porovnání s klinicko-patologickými daty identifikuje kandidátní geny pro další studium. To by mohlo v konečném výsledku vést k vytvoření nových diagnostických markerů pro terapii karcinomu prsu. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Profilování genové exprese na úrovni jednotlivých buněk a kontrola kvality
Švec, David ; Kubista, Mikael (vedoucí práce) ; Beneš, Vladimír (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Profilování genové exprese na úrovni jednotlivých buněk a kontrola kvality David Švec Biotechnologický ústav AV ČR, Laboratoř genové exprese, Praha, Česká republika TATAA Biocenter, Výzkum & vývoj, Göteborg, Švédsko Abstrakt: Profilování genové exprese je velmi důležitý nástroj, který umožňuje získat informaci o výskytu mRNA ve vzorku tkáně či v jednotlivých buňkách. Slouží k charakterizaci typů buněk, stanovení stupně diferenciace i ke studiu jejich patologického stavu na molekulární úrovni. V naší nově založené laboratoři jsme vyvinuli qPCR tomografii s vysokým rozlišením odhalující distribuci maternálních mRNA v rámci jednoho oocytu. Distribuce mRNA v embryu je důležitá pro pochopení následujícího vývoje jedince. Metoda qPCR tomografie kombinuje rozdělení oocytu na desítky řezů a kvantifikaci exprese až padesáti genů v každém vzorku. Toho bylo možné dosáhnout až po optimalizaci protokolu pro vysokokapacitní qPCR instrument BioMark. Další snahou bylo qPCR tomografii doplnit o zobrazení studované tkáně a její výběr pomocí laserové mikrodisekce. Cílem bylo vytvořit první mapu distribuce mRNA desítek nejdůležitějších genů při vývoji myší stoličky v prostoru a čase, která by popsala interakce genů v jednotlivých stádiích, případně ve vybraných buňkách. Dalším úkolem této dizertace je ukázat vývoj...
|
|
|
Expresní profilování jednotlivých buněk a jejich analýza
Novosadová, Vendula ; Kubista, Mikael (vedoucí práce) ; Beneš, Vladimír (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
5 Souhrn Buňky jsou základním stavebním kamenem všech vyšších organismů. Pro pochopení komplexity tkání a celých orgánů je nutné porozumět buněčné heterogenitě a chování jednotlivých buněk. I buňky stejného typu mají v daném okamžiku odlišné chování a různé složení mRNA, které je způsobeno stochastickou expresí genů a proteinů. Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (qPCR) je jednou z nejcitlivějších metod pro detekci mRNA, přesto se však při analýze jednotlivých buněk získává velké množství chybějících dat. Tento fakt je dán nepřítomností transkriptu nebo jeho malým množstvím, které je pod mezí detekce. Z tohoto důvodu je nutné vytvořit nové postupy pro statistickou analýzu. V této práci je diskutován potenciál genového expresního profilování jednotlivých buněk (single cells) pomocí vysokokapacitního přístroje Biomark se zaměřením na analýzu dat a jejich biologickou interpretaci. Ukazuje se, že mezi dva klíčové kroky v analýze jednotlivých buněk patří normalizace a doplnění chybějících dat. Jednotlivé buňky nejsou normalizovány referenčním genem, ale jsou normalizovány na počet buněk, ze kterých je exprese měřena. Chybějící údaje jsou nahrazeny hodnotou rovné jedné čtvrtině nejmenšího měřitelného množství transkriptu v buňce. Práce se dále věnuje možnostem vizualizace dat získaných měřením exprese v...
|
host ::
RSS.