|
|
Charakterizace TRAILem indukované, receptor-specifické signalizace v nádorových buňkách.
Peterka, Martin ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Rohlena, Jakub (oponent)
TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) je protein patřící do TNF rodiny exprimovaný hlavně hematopetickými buňkami. TRAIL je zajímavý zejména svou schopností vyvolat apoptózu v mnohých nádorových buňkách. TRAIL je také schopen iniciovat několik dalších signálních drah, jako například MAP kinázovou signalizaci, či aktivaci NF-B dráhy. Lidský TRAIL váže celkem pět receptorů, z nichž pouze dva jsou schopny iniciovat apoptotickou a neapoptotickou signalizaci v cílových buňkách. Oba receptory jsou široce koexprimovány na zdravých i nádorových buňkách. Jaký je relativní příspěvek jednotlivých receptorů k TRAILem indukované signalizaci není dobře prostudováno. V této práci jsme pomocí DR4/DR5-specifických variant ligandu TRAIL prozkoumali, jakým způsobem se tyto jednotlivé receptory zapojují do TRAILem indukované aktivace apoptózy a drah NF-B, JNK, p38, ERK1/2 a TAK1 ve vybraných kolorektálních nádorových buňkách. Ukazujeme, že v DLD-1 buňkách apoptóza a JNK kináza jsou aktivovány zejména DR4-specifický ligandem. V rezistentní linii HT-29, ačkoliv apoptotický komplex DISC byl formován zejména DR4-specifickým ligandem, dráha NF-B byla indukována zejména DR5 selektivním ligandem. V ostatních prozkoumaných případech vyvolaly oba ligandy srovnatelné odpovědi. Tato práce nabízí první systematický pohled na...
|
|
|
Mechanismus, regulace a využití TRAILem indukované apoptózy nádorových buněk
Horová, Vladimíra ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Truksa, Jaroslav (oponent) ; Živný, Jan (oponent)
Člen proteinové rodiny faktorů příbuzných s TNF - transmembránový ligand TRAIL (tumour necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) - přitahuje pozornost díky své schopnosti specificky a efektivně vyvolávat apoptotickou smrt u různých typů rakovinných buněk. Přesto se často setkáváme se sekundární rezistencí, kterou rakovinné buňky vyvíjejí k působení ligandu TRAIL, přičemž molekulární mechanizmy související s tímto jevem nejsou doposud uspokojivě objasněny. V první publikaci jsme se zaměřili na analýzu role endozomální acidifikace v proximálních signalizačních drahách ligandu TRAIL. Pomocí specifických inhibitorů bafilomycinu A1 (Baf A1) a konkanamycinu A (CCA) jsme u několika vnímavých kolorektálních buněčných linií zablokovali vakuolární ATPázu, která zodpovídá za vnitřní okyselování endocytických váčků a lyzozómů. Zjistili jsme, že citlivost takto ošetřených buněk k cytotoxickému působení ligandu TRAIL je významně a reproducibilně potlačena. Buňky vykazovaly minimální štěpení prokaspázy-8 a výrazně zpomalena (i když pouze dočasně) byla i agregace receptorových komplexů a jejich pohyb po buňce v klatrinem obalených váčcích. Povrchová exprese receptorů TRAIL-R1/DR4 a TRAIL-R2/DR5, jejich internalizace po navázání ligandu TRAIL i aktivace antiapoptotických NF-κB a MAP kinázových...
|
|
|
Apoptóza nádorových buněk: role TRAILu a kaspásy 10
Truxová, Iva ; Živný, Jan (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent)
Jednou z klíčových vlastností nádorových buněk je schopnost uniknout programované buněčné smrti (apoptóze). V mnoha typech nádorových buněk byly nalezeny somatické mutace proapoptotických genů, které deregulují (inaktivují) apoptózu. Kaspáza 10 je iniciátorová kaspáza, jejíž fyziologická funkce není stále dobře prozkoumána. Také její schopnost nahradit kaspázu 8 v apoptotické signalizaci indukované receptory smrti zůstává kontroverzní. Ovšem některé nalezené mutace v CASP10 genu, které byly spojeny s defekty v apoptóze (79, 81), napovídají, že i tato kaspáza by mohla být klíčová pro iniciaci apoptózy. V naší laboratoři byla u Jurkat (lidská T-buněčná akutní lymfoblastická leukémie) klonu rezistentního na TRAIL - J-TR1 nalezena heterozygotní mutace v CASP10 genu, která ovlivňuje aminokyselinové složení poblíž aktivního místa enzymu. Cílem této práce bylo potvrdit mutaci ARMS-PCR a zjistit, zda bude nadprodukce normální (nemutované) resp. mutované kaspázy 10 D v TRAIL senzitivních resp. TRAIL rezistentních Jurkat buňkách (J-WT resp. J-TR1) ovlivňovat apoptózu indukovanou TRAILem. Mutace byla potvrzena. Byly vypěstovány stabilní klony J-WT resp. J-TR1 buněk transfekované expresním vektorem s vloženou nemutovanou resp. mutovanou CASP10 D (CASP10 D WT resp. MUT). Nadprodukce mutované kaspázy 10 D v J-WT klonech...
|
|
|
Typ buněčné smrti a blok superinfekce v buňkách infikovaných virem vakcinie
Lišková, Jana ; Mělková, Zora (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent) ; Němečková, Šárka (oponent)
Virus vakcinie (VACV) byl v minulosti využíván v eradikační kampani proti černým neštovicím. Infekce VACV je ve většině buněčných typů, včetně epiteliálních, lytická, což odpovídá nekrotické buněčné smrti. Při infekci epiteliálních linií HeLa G a BSC-40 VACV kmenem Western Reserve (WR) však byla v naší laboratoři již dříve pozorována aktivace kaspáz, která je typická pro apoptózu. V této práci byl blíže studován typ buněčné smrti buněk HeLa G a BSC-40 infikovaných VACV a také byla charakterizována aktivace a aktivita kaspáz u těchto infikovaných buněk. U buněk HeLa G infikovaných VACV kmene WR byla identifikována apoptóza na základě kondenzace jader, aktivity kaspázy 3 a štěpení substrátů smrti. V infikovaných buňkách HeLa G byla také detekována aktivace i aktivita kaspáz 2 a 4. U buněk BSC-40 infikovaných VACV kmenem WR apoptóza ani aktivita kaspáz pozorována nebyla, aktivace kaspáz 2 a 4 však zde byla detekována také. V infikovaných buňkách obou buněčných linií byla také štěpena prokaspáza 3 a 12. Vakcinační kmeny Dryvax a Praha indukovaly apoptózu v buňkách HeLa G i BSC-40, což bylo prokázáno apoptotickou morfologií jader a také detekcí štěpení substrátu exekutorových kaspáz PARP. Naše výsledky naznačují, že typ buněčné smrti infikovaných buněk může souviset s virulencí a imunogenitou různých...
|
|
|
Molekulární a funkční charakterizace receptoru DR 6
Klíma, Martin ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Živný, Jan (oponent) ; Kovář, Marek (oponent)
Receptor DR6 ("receptor smrti-6", TNFRsf21/CD358) je členem rodiny TNFR, který se pravěpodobně účastní regulace proliferace a diferenciace T- a B-lymfocytů a neurálních buněk. Lidský DR6 je 655 aminokyselin dlouhý transmembránový protein typu I, který obsahuje čtyři domény CRD ve své extracelulární části a po jedné doméně DD a CARD v části cytoplazmatické. Nadprodukce DR6 v některých nádorových buňkách vede k apoptóze, a/nebo aktivaci transkripčního faktoru NF-κB a kináz rodiny JNK. V první naší práci jsme se věnovali charakterizaci molekulárních vlastností receptoru DR6 včetně analýzy jeho posttranslačních modifikací. Zjistili jsme, že DR6 je extenzivně modifikovaný protein a jeho posttranslační modifikace zahrnují S-palmitylaci a jak N-, tak i O-glykosylaci. Šest N- glykosylačních a jedno S-palmitylační místo jsme zamapovali do příslušných aminokyselinových zbytků. Spojovací část mezi doménami CRD v extracelulární části DR6 a jeho transmembránovou doménou, která obsahuje oblast bohatou na serin, threonin a prolin se seskupenými predikovanými O-glykosylačními místy, je nezbytná pro transport DR6 na plazmatickou membránu. N-glyko- sylace, ale překvapivě nikoli S-palmitylace, může hrát roli ve směřování DR6 do lipidových raftů. V další části této práce jsme shrnuli výsledky studie analyzující regulaci...
|
|
|
Úloha endocytózy a endosomální acidifikace v apoptóze indukované ligandem TRAIL
Hradilová, Naďa ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Kovář, Jan (oponent)
Pro úspěšný přenos apoptotického signálu je nezbytné efektivní formování multimerního komplexu DISC (death-inducing signaling complex) a následná aktivace iniciační kaspázy-8. Avšak počáteční děje vedoucí plné aktivaci kaspáz nejsou zcela objasněny. Jedním z faktorů, které mohou iniciaci vnější receptorové dráhy ovlivnit, je endocytóza komplexu TRAILDR4/ 5-DISC (tzv. receptozom). Recentní studie zabývající se úlohou endocytózy TRAILového receptozomu podávají rozporuplné výsledky. U různých buněčných linií byl pozorován proapoptotický, antiapoptotický nebo dokonce žádný vliv endocytózy receptozomu. V této práci jsme se zaměřili na určení úlohy endocytózy a následné acidifikace TRAIL receptozomů během TRAILem indukované apoptózy u buněčných linií odvozených od kolorektálního karcinomu. Prokázali jsme se, že na klatrinu závislá endocytóza TRAILových receptozomů a zároveň i endozomální a lyzozomální acidifikace je potřebná pro efektivní aktivaci kaspázy-8 a kaspázy-3 během časné fáze apoptózy. Inhibice endocytózy a acidifikace vedly k poklesu apoptotické signalizace během první hodiny od indukce apoptózy. Tento inhibiční efekt byl pouze přechodný a nedošlo k úplnému zastavení apoptotické signalizace. Inhibice acidifikace pomocí inhibitorů V-ATPázy způsobila také celkové zpomalení apoptotických dějů a změny v...
|
|
|
Úloha mitochondriální dráhy v indukci apoptózy taxany u buněk nádorů prsu
Schmiedlová, Martina ; Kovář, Jan (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent)
Apoptóza je jedním z mechanismů programované buněčné smrti, ke které dochází u nádorových buněk prsu po aplikaci taxanů. K její indukci může principielně docházet buď vnější nebo vnitřní dráhou. Diplomová práce má za cíl přispět k objasnění úlohy a mechanismů vnitřní mitochondriální dráhy indukce apoptózy po aplikaci taxanů (paclitaxel a SB-T-1216) na modelu buněčných linií karcinomu prsu SK-BR-3 (nefunkční protein p53, funkční kaspáza 3) a MCF-7 (funkční protein p53, nefunkční kaspáza 3). Konkrétně jsme sledovali vliv obou testovaných taxanů na mitochondriální membránový potenciál, hladinu ROS, expresi a lokalizaci proteinů regulujících vnitřní mitochondriální dráhu. U buněčné linie SK-BR-3 vedla aplikace obou taxanů k zhroucení mitochondriálního membránového potenciálu, avšak ne u buněčné linie MCF-7. Zjistili jsme, že se po aplikaci obou taxanů nemění exprese proteinu Bax a ani Smac/DIABLO u obou testovaných linií. U linie SK-BR-3 došlo na rozdíl od linie MCF-7 po aplikaci taxanů k poklesu exprese proteinu Bid. Po aplikaci taxanů nedošlo k translokaci proteinů Bax a Bid (tBid) z cytosolu na mitochondrie ani u jedné z testovaných linií. Nezjistili jsme také uvolňování proteinu Smac/DIABLO z mitochondrií do cytosolu. U buněčné linie SK-BR-3 jsme však pozorovali po aplikaci taxanů uvolňování...
|
|
|
Vliv nádorových fibroblastů na přežívání, proliferaci a invazivitu nádorových buněk.
Nováková, Gita ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
Nádorové mikroprostředí představuje, vedle vlastních nádorových buněk, strukturně i funkčně významnou součást nádoru. Obdobně jako v orgánech je i toto prostředí je vytvářeno několika buněčnými typy (fibroblasty, buňkami imunitního systému, endoteliálními buňkami aj.) a nebuněčnou složkou (především extracelulární matrix). Všechny tyto součásti formují vhodné prostředí pro vlastní nádorové buňky - podporují jejich růst a množení, brání imunitnímu systému v jejich zničení a zabezpečují i jejich výživu. Jednu z hlavních složek nádorového mikroprostředí představují nádorové fibroblasty. Vznikají z různých buněčných typů (stávajících fibroblastů, endoteliálních buněk, epiteliálních buněk atd.) vlivem faktorů produkovaných nádorovými buňkami (především TGF-β). Tyto aktivované nádorové fibroblasty (cancer associated fibroblasts, CAFs) exprimující α-SMA nejsou z tkáně odstraňovány podobně jako fibroblasty účastnící se reparačních procesů. Naopak v tkáni přetrvávají a produkují řadu pro-nádorových faktorů, mezi nejvýznamnější patří SDF-1, HGF, IGF-1, IL-6, VEGF, PDGF-C, TGF-β, MMPs aj. CAFs a jimi sekretované faktory ovlivňující téměř všechny znaky nádoru, tzv. Hallmarks of Cancer - podporují proliferaci nádorových buněk, brání jejich vstupu do apoptózy, podporují tvorbu cévního zásobení nádoru, aktivně přetváří...
|
|
|
Molecular mechanisms of apoptosis regulation by fatty acids in pancreatic β-cells
Němcová, Vlasta ; Kovář, Jan (vedoucí práce) ; Anděra, Ladislav (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Incidence diabetu 2. typu velmi rychle narůstá a představuje velkou hrozbu pro zdravotnictví i ekonomiku 21. století. Diabetes 2. typu je jasně asociován s obezitou a dysfunkce a apoptóza pankreatických β buněk v důsledku zvýšené hladiny mastných kyselin v krvi je považována za důležitý faktor přispívající k rozvoji tohoto onemocnění. Molekulární mechanismy zodpovědné za neblahé účinky mastných kyselin však nejsou dostatečne známy. Cílem tohoto výzkumného projektu bylo přispět k objasnění mechanismů, kterými nasycené a nenasycené mastné kyseliny regulují viabilitu a indukci apoptózy u lidských pankretických β buněk in vitro. U lidské β-buněčné linie NES2Y jsme ukázali, že zvýšené hladiny nasycených mastných kyselin přijímaných potravou (kyselina palmitová a stearová) indukují apoptózu pankreatických β buněk, narozdíl od příslušných nenasycených mastných kyselin (např. kyselina palmitolejová a olejová). Zjistili jsme, že apoptóza indukovaná kyselinou stearovou je doprovázena signifikantní aktivací kaspázy 2, 6, 7, 8 a 9, ale ne signifikantní aktivací kaspázy 3. Nebyla však spojena s vyléváním cytochromu c, změnou exprese proteinů PIDD, Fas a FasL a s aktivací proteinu p53. Působení kyseliny stearové vedlo k rychlé aktivaci signálních drah stresu endoplazmatického retikula (ER) (tj. IRE1α, PERK a...
|
|
|
Activation and function of BH3-only proteins from the Bcl-2 family
Peterka, Martin ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Pavlů, Barbora (oponent)
Proteiny z rodiny Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) jsou klíčovými regulátory apoptózy u mnohobuněčných živočichů. U savců tyto proteiny regulují permeabilizaci vnější mitochondriální membrány (MOMP), jež vede k uvolnění pro-apoptotických molekul z mezimembránového prostoru mitochondrií a následné apoptóze. Poruchy v signalizaci těmito proteiny mohou u savců vyústit v různé patologické stavy včetně rakoviny. BH3 proteiny tvoří pro-apoptotickou podskupinu Bcl-2 rodiny. Fungují zejména jako senzory různých pro-apoptotických podnětů, jako je například nedostatek cytokinů, genotoxický stres či aktivace "receptorů smrti". U savců bylo identifikováno přes deset BH3 proteinů, z nichž osm se účastní regulace MOMP. Těmito "konvenčními" BH3 proteiny jsou Bim, Bid, Puma, Noxa, Bad, Hrk, Bik and Bmf. Tato práce nabízí přehled o jejich původu, struktuře, aktivaci a funkci v apoptotické signalizaci.
|
host ::
RSS.