|
|
Role of promoter in the regulation of alternative splicing
Kozáková, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Blažek, Dalibor (oponent)
Bylo ukázáno, že až 95 % genů obsahujích více než dva exony, podstupuje alternativní sestřih. Regulace alternativního sestřihu je velmi složitý proces. Většina intronů je odstraněna z pre- mRNA během transkripce a přibývá důkazů, které poukazují na důležitost chromatinových modifikací v regulaci alternativního sestřihu. V této práci ukazujeme, že inhibice histonových deacetyláz (HDACs), která způsobuje zvýšení acetylace histonů a zrychlení elongace Pol II, ovlivňuje alternativní sestřih přibližně 700 genů. Identifikovali jsme HDAC1, jejíž enzymatická aktivita je zodpovědná za změny v alternativním sestřihu. Poté jsme se zaměřili na Brd2 protein, který váže acetylované histony a ovlivňuje alternativní setřih ~ 300 genů. Dále jsme ukázali, že se Brd2 protein váže na promotory genů, které ovlivňuje. Dále jsme zjistili, že deplece histonacetyltransferázy p300 podporuje zahrnutí alternativního EDB exonu fibronektinového genu (FN1) v mRNA. Asociace p300 proteinu s CRE místy v promotoru je zprostředkována interakcí s CREB transkripčním faktorem. Vytvořili jsme sestřihové reportéry pod kontrolou arteficiálních promotorů obsahující CRE místa. Delece i mutace CRE míst v promotoru ovlivnila alternativní sestřih EDB exonu stejně jako deplece p300 proteinu. Poté jsme ukázali, že deplece p300 snižuje acetylaci...
|
|
|
GAL4/UAS binární systém jako nástroj pro studium genové funkce
Soukup, Tomáš ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
GAL4/UAS systém je bipartitním nástrojem genového inženýrství, umožňujícím ektopickou expresi in vivo v časovém i tkáňově specifickém kontextu. Design této techniky vychází z mechanismů regulace genové transkripce, objasněných z veliké části experimentálním studiem regulace metabolického okruhu pro zpracování galaktosy organismu Saccharomyces cerevisiae. Nezávislou inkorporací genu pro transkripční faktor Gal4p a jeho vazebné sekvence (UAS) za pomoci transposibilních technik a technik pro integraci do specifické části genomu je možné generovat stovky stabilních, transgenních linií. Křížením jedince z GAL4 linie s jedincem z UAS linie lze následně získat jedince, vykazujícího za vhodných, regulovatelných podmínek ektopickou expresi. Tato práce představuje syntézu základních principů GAL4/UAS systému a jeho variant, adaptovaných zejména pro potřeby genových manipulací s modelovými organismy Drosophila melanogaster a Danio rerio. Dále tento text shrnuje propojení GAL4/UAS systému s dalšími technikami a ve stručnosti poukazuje na možnosti praktické aplikace zejména na poli neurologie. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Localization matters: function of paxillin and phopholipids in the cell nucleus
Marášek, Pavel ; Hozák, Pavel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Žárský, Viktor (oponent)
(Czech) Paxillin i PIP2 jsou dobře známé součásti každé buňky, i když odlišné povahy. Paxillin, protein fokálních adhezí, šíří signál z extracelulární matrix prostřednictvím integrinů a receptory růstových faktorů, a tak reguluje buněčnou motilitu a migraci buněk (Schaller, 2001). PIP2, hlavní stavební kámen buněčných membrán, který je fosfolipasou C štěpen na tzv. druhé posly (Hokin and Hokin 1953; Streb et al. 1983). V nedávné době bylo prokázáno, že obě molekuly jsou také lokalizovány v jádře. Jejich dosud známé funkce jsou detailně prozkoumány, ale my nyní odhalujeme zcela odlišné funkce těchto biologických složek, a to navíc v úplně odlišných částech buňky, než kde se jejich lokalizace předpokládá. V této práci ukazujeme, že paxillin je důležitým faktorem buněčného jádra, kde kontroluje expresi dvou důležitých genů IGF2 a H19, které řídí růst buňky. Paxillin nemění alelickou expresi těchto imprintovaných genů, ale reguluje chromosomální interakce mezi promotory IGF2/H19 a jejich společným enhancerem na aktivní alele. Přesněji řečeno, paxillin stimuluje interakci mezi enahncerem a promotorem genu IGF2, čímž zesiluje transkripci IGF2, zároveň paxillin brání interakci mezi enhancerem a promotorem H19, a tím snižuje transkripci H19. Nalezli jsme paxillin v komplexu s kohesiny a také Mediatorem RNA...
|
|
|
Vliv sekvencí intronů na efektivitu sestřihu v Saccharomyces cerevisiae.
Oplová, Michaela ; Půta, František (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Sestřih pre-mRNA je vysoce regulovaným buněčným procesem. Regulace tohoto procesu vyplývá ze současné souhry spliceosomu a dalších sestřihových faktorů, které dokážou interpretovat cis-elementy molekuly pre-mRNA. Krátké konzervované sestřihové sekvence intronu představují základní a nezbytné elementy pro vystřižení intronových sekvencí z primárního transkriptu, přesto ale nejsou dostatečnými prvky intronu pro efektivní proces sestřihu. Další vlastnosti molekuly pre-mRNA zasahují do složité regulace sestřihu. Ve své práci se zabývám vlivem sekvencí intronů z genů ACT1 a MAF1 na efektivitu sestřihu v buňkách s narušeným spliceosomem (prp45(1-169)). Výsledky ukazují regulační úlohu oblasti intronu genu ACT1 mezi místem větvení (BP) a 3' sestřihovým místem (3'ss), která udržuje efektivní sestřih v mutantních buňkách. Konkrétní element intronu genu ACT1 v oblasti BP-3'ss však nebyl identifikován. Ve své práci dále ukazuji, že alternativní BP sekvence nacházející se v intronu genu ACT1, která je lokalizována mimo oblast BP-3'ss, je dalším elementem, který moduluje efektivitu sestřihu u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Práce se dále věnuje sestřihovým faktorům, které by mohly figurovat v mechanismu výběru 3'ss. Na umisťování 3'ss do aktivního centra spliceosomu se významně uplatňuje heterodimer proteinů...
|
|
|
Aptamery - vazebné a regulační vlastnosti molekul RNA
Oplová, Michaela ; Půta, František (vedoucí práce) ; Dzijak, Rastislav (oponent)
Aptamery jsou jednořetězcové ribo- či deoxyribonukleotidy, obvykle délky 20-80 nukleotidů, které prostřednictvím intramolekulárních interakcí zaujímají komplexní trojrozměrné struktury a s vysokou afinitou specificky váží malé cílové molekuly. Generovány jsou in vitro pomocí revoluční technologie SELEX (z angl. systematic evolution of ligand by exponential enrichment) a jejími modifikacemi. Skutečnost, že lze připravit aptamery vážící prakticky jakoukoliv cílovou molekulu, vzbudila značnou pozornost vědecké a medicínské komunity, neboť z aptamerů činí slibné diagnostické a terapeutické nástroje. Aptamery existují i přirozeně; aptamerové domény byly opakovaně nalezeny jako součást regulačních elementů genové exprese bakterií, kde fungují jako specifické receptory buněčných metabolitů. Doména TPP byla nalezena rovněž u rostlin, hub a zelených řas.
|
|
|
Příprava a testování polyklonálních protilátek proti Cbf11 a Cbf12, transkripčním faktorům rodiny CSL kvasinek Schizosaccharomyces pombe
Tvarůžková, Jarmila ; Půta, František (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ, Suppressor of Hairless, Lag-1) jsou transkripční faktory s klíčovou rolí ve vývoji metazoálních organismů, kdy působí nejen jako součást dráhy Notch, ale i nezávisle na této dráze. Homology proteinů CSL byly identifikovány i v houbových organismech postrádajících signální dráhu Notch. Proteiny Cbf11 a Cbf12 jsou antagonistické paralogy důležité pro koordinaci buněčného a jaderného dělení, regulaci buněčné adhese a integritu chromosomů v jednobuněčné kvasince Schizosaccharomyces pombe. Rovnováha v aktivitě proteinů Cbf11 a Cbf12 je klíčová pro jejich správnou funkci a doposud připravené chromosomálně značené alely těchto proteinů vykazují chování v různé míře odlišné od divokého typu. Dostupnost specifických protilátek by tedy výrazně usnadnila studium biologické funkce proteinů CSL v kvasince S. pombe. V předkládané bakalářské práci je prezentován návrh a příprava imunogenu a testování protilátek proti proteinům CSL získaných z komerčního zdroje. Pomocí bioinformatických nástrojů byly vybrány vhodné imunogenní fragmenty proteinů Cbf11 a Cbf12 a korespondující sekvence DNA byly klonovány do expresního plasmidu. Exprese solubilních proteinů značených hexahistidinem na N-konci byla optimalisována a nativní protein byl purifikován pomocí afinitní (chelatační)...
|
|
|
Regulation of pre-mRNA splicing in S. cerevisiae: where RNA cooperates with proteins.
Gahura, Ondřej ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Ondřej Gahura, Dizertační práce 2011 Regulace sestřihu pre-mRNA v S. cerevisiae: kooperace RNA a proteinů Abstrakt Odstraňování intronů z transkriptů probíhá prostřednictvím sestřihu v reakci katalyzované velkým jaderným komplexem - spliceosomem. Sestřih je nesmírně komplikovaný a dynamický proces, v němž koordinované fungování pěti malých molekul RNA a řady proteinů zajišťuje splnění požadavků na extrémní přesnost a flexibilitu. Pro důkladné pochopení sestřihu pre-mRNA je nezbytné rozklíčovat role jednotlivých komponent spliceosomu a porozumět všem dílčím mechanismům. První část práce se zabývá rolí sestřihového faktoru Prp45 v kvasince Saccharomyces cerevisiae. Mapování genetických interakcí alely prp45(1-169) ukazuje na vztah mezi Prp45, NTC komplexem a druhým sestřihovým krokem. Analýza interakcí pomocí dvouhybridního systému a purifikace sestřihových komplexů dokladuje roli C-koncové části Prp45 v regulaci a/nebo vyvazování helikázy Prp22 do spliceosomu. Experimenty s reportérovými substráty prokazují, že Prp45 je vyžadován pro efektivní sestřih určité skupiny intronů. Naše pozorování podporují hypotézu, že role Prp45 v sestřihu je konzervována v evoluci. Druhá část práce je věnována studiu vlivusekundárních struktur intronů na identifikaci 3' sestřihových míst (3' splice site; 3'ss). Ukázali jsme, že...
|
|
|
Regulace pre-mRNA sestřihu v prostředí buněčného jádra
Hnilicová, Jarmila ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Dvořák, Michal (oponent)
Eukaryotní geny obsahují nekódující sekvence - introny, které jsou z pre-mRNA odstraňovány sestřihovými komplexy. Sestřihové komplexy se skládají z pěti RNA-proteinových podjednotek (U1, U2, U4/U6 a U5), které postupně nasedají na pre-mRNA a jsou společně s dalšími bílkovinami nutné pro vystřižení intronu. Mutace v bílkovinách důležitých pro RNA sestřih mohou způsobovat vážná onemocněním, například mutace zvaná AD29 vedoucí k záměně jediné aminokyseliny v proteinu hPrp31 (tato bílkovina je součástí U4/U6 sestřihového komplexu) je příčinou nemoci retinitis pigmentosa, která často končí úplnou slepotou. Ukázali jsme, že hPrp31 AD29 mutant je nestabilní a není řádně začleněný do sestřihových komplexů. Přesto vadný hPrp31 zřejmě má vliv na metabolismus buňky, protože zpomaluje buněčný růst a dělení, což by mohlo vysvětlit, proč tato mutace vede k retinitis pigmentosa. Dále se zaměřujeme na roli buněčného jádra v pre-mRNA sestřihu. Nové U4/U6·U5 snRNP částice jsou přednostně skládány v nemembránových jaderných strukturách - Cajalových tělíscích. Zjistili jsme, že Cajalova tělíska jsou také důležitá pro recyklaci U4/U6·U5 snRNP. Vedle toho jsme se zaměřili na roli chromatinu (především acetylace histonů) při regulaci alternativního sestřihu. Pomocí inhibitorů histonových deacetylázy jsme změnili...
|
|
|
To cap or not to cap? Eukaryotic translation initiation with a special interest in human opportunistic pathogen C. albicans
Feketová, Zuzana ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Vanáčová, Štěpánka (oponent)
Candida albicans je bezpochyby veľmi dôležitý oportúnny patogén, ohrozujúci hlavne imunokompromitovaných pacientov. Pokiaľ viem, ide o jediný organizmus, ktorý je schopný prežívať s nemetylovanými čiapočkami nachádzajúcimi sa na 5'konci mRNA. Funkčnou analýzou som potvrdila, že orf19.7626 kóduje translačný iniciačný faktor 4E C. albicans (Ca4E). Predpoklad, že Ca4E proteín by mohol rozpoznávať nemetylované čiapočky, sa nám v modelovom organizme S. cerevisiae nepodarilo potvrdiť. Rod Candida má však aj ďalšiu zvláštnosť- dvojaké dekódovanie CUG kodónu. Vo veľkej väčšine prípadov je dekódovaný ako serín, ale môže ísť aj o leucín, takže vzniká tzv. "štatistický proteóm". Jeden takýto kodón je aj súčasťou mRNA Ca4E proteínu. U C. albicans by sa teda mohli vyskytovať súčasne dve varianty Ca4E - Ca4ELeu a Ca4ESer . Obe formy dokážu nahradiť eIF4E S. cerevisiae, ale spôsobujú termosenzitívny fenotyp, ktorý je výraznejší v prípade Ca4ELeu proteínu. Zmiernenie termosenzitívneho fenotypu sa podarilo docieliť koprodukciou Ca4E spolu s C. albicans eIF4G proteínom (Ca4G). Úlohou eIF4G je prepojiť mRNA s 43S podjednotkou ribozómu pomocou interakcie s eIF4E, ktorá zároveň zvyšuje afinitu eIF4E k čiapočke. Preto sa domnievam, že interakcia Ca4E s eIF4G proteínom S. cerevisiae nie je dostačujúca. Ca4G taktiež...
|
|
|
Role of RecQ helicases in maintenance of genomic stability during mitosis
Černoch, Marek ; Janščák, Pavel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
Helikázy jsou proteiny schopné rozplétání nukleových kyselin, jejich dysfunkce může být nebezpečná pro genomovou stabilitu buňky. Pět helikáz rodiny RecQ identifikovaných v lidských buňkách se podílí na mnoha buněčných pochodech během celého buněčného cyklu včetně mitózy a jsou proto důležité pro jejich správnou funkci. Mutace v helikázách RecQ může způsobit jejich dysfunkci a vážně narušit různé buněčné procesy, například replikaci DNA, kontrolu poškození DNA nebo rozdělení sesterských chromatid. Mutace mohou také vést k nebezpečným syndromům, jejichž typickým příznakem je zvýšené riziko vzniku rakoviny.
|
host ::
RSS.