|
|
Analýza vlivu mutací v C-terminální doméně na vnitrobuněčnou lokalizaci nukleofosminu
Kráčmarová, Markéta ; Brodská, Barbora (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Mutace v C-koncové ásti genu pro nukleofosmin (NPM) pat í mezi asté genetické aberace u nemocných s akutní myeloidní leukémií (AML). Ve své práci jsem se zam ila na charakterizaci C-terminálních mutací typu A, B a E u onemocn ní AML. Za ú elem sledování lokalizace a chování tohoto proteinu byly zkonstruovány t i vektory nesoucí gen pro NPM s jednotlivými mutacemi a jeden vektor s intaktním genem pro NPM. K produkci rekombinantních protein byly zvoleny t i sav í expresní systémy bun ných linií HEK293T, HeLa a NIH 3T3. Fluorescen ní mikroskopií a nep ímou imunodetekcí byla popsána vnitrobun ná lokalizace mutovaných forem NPM (mutNPM). MutNPM typu A a B vykazovaly tém identickou, p evá n cytoplazmatickou lokalizaci, zatímco mutNPM typu E byl p ítomný v jadérku i cytoplazm sou asn . Lokalizace jednotlivých mutovaných forem v ak byla výrazn ovlivn na pou itou bun nou linií. Bylo prokázáno, e exogenní a endogenní NPM spolu interagují a skrze oligomerizaci vzájemn ovliv ují svoji vnitrobun nou lokalizaci. Studium genetických aberací má význam nejen pro klasifikaci nemocných do jednotlivých prognostických skupin, ale také v objasn ní patogeneze nádorových onemocn ní. Analýza vztahu mezi typem mutace a lokalizací mutovaného NPM pomáhá porozum t vlivu konkrétní mutace NPM na vznik a progresi AML a specifikovat její...
|
|
|
Design siRNA a vliv modifikací na jejich stabilitu a účinnost
Kuldanová, Kateřina ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Návrh krátkých interferujících RNA (siRNA) je základním krokem k úspěšné RNA interferenci (RNAi). Navrhnout vhodný siRNA duplex ale není zcela triviální, neboť existuje několik problematických oblastí, jako jsou například stabilita siRNA duplexů v přítomnosti nukleáz, účinnost eliminace cílové mRNA, sekvenčně specifická eliminace necílových mRNA, cytotoxicita a imunogenicita, ovlivňujících funkčnost siRNA duplexů a tedy i jejich využitelnost v medicíně a dalších oborech. Porozumění principům fungování siRNA duplexů při RNAi je nezbytným krokem k vyřešení výše uvedených překážek na cestě k účinným léčivům. Prostředkem optimalizace popsaných vlastností je úprava návrhu siRNA duplexů pomocí různých modifikací. Modifikovat lze fosfodiesterovou kostru, báze i ribózu. V každé z těchto skupin jsou známy modifikace, které mají na siRNA duplexy a následnou RNA interferenci pozitivní vliv. Tato práce předkládá dosavadní poznatky o několika nejznámějších modifikacích, jako jsou thiofosfátová substituce, 2′-deoxy-2′-fluoronukleotidy, 2′-O-methyl ribonukleotidy a LNA nukleotidy, a o větším počtu méně známých modifikací, jako jsou boranofosfátová substituce, 4′-thioribonukleotidy, 2′-O-methyl-dithiofosfátová modifikace a mnoho dalších, které ovlivňují vlastnosti siRNA duplexu.
|
|
|
Transgenic technologies based on transposons
Dobiášovská, Ivana ; Kozmik, Zbyněk (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Genové inženýrství je jednou z vedoucích technologií biologického výzkumu. Transgeneze, jedna z nejvýznamnější technik genového inženýrství, umožňuje studium genetických aspektů organismálních systémů a napomáhá tak pochopení funkce a struktury genomů. Transposony jsou přirozeně se vyskytující mobilní genetické elementy, které mohou být uměle využity k začlenění transgenu do genomu hostitelských buněk. Katalýza tohoto zásadního kroku v průběhu transgeneze činí transposony užitečným genetickým nástrojem. Práce usiluje o prezentaci eukaryotických DNA transposonů využívajích cut-and-paste mechanismus integrace, společně s významnými mechanismy ovlivňujícími jejich funkci jako možnosti vhodných systémů pro genový přenos.
|
|
|
Studium esenciality genu glmM kodujiciho fosfoglukosaminmutasu Streptococcus pneumoniae.
Krupička, Jiří ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Fosfoglukozaminmutáza (GlmM) představuje enzym hrající roli v biosyntéze buněčné stěny bakterií. Hlavním záměrem této diplomové práce bylo zjistit, zda je gen glmM esenciální pro životaschopnost Streptococcus pneumoniae. Za tímto účelem jsme vytvořili merodiploidní kmen obsahující dvě kopie glmM - nativní gen a jeho ektopickou kopii pod kontrolou inducibilního zinkového promotoru. Delecí nativního genu glmM jsme vytvořili mutantní kmen, u něhož jsme analyzovali životaschopnost a fenotyp v médiu s různými koncentracemi zinečnatých iontů, induktoru exprese ektopické kopie glmM. Zjistili jsme, že životaschopnost mutantního kmene je striktně závislá na koncentraci induktoru v médiu a úbytek GlmM se u buněk projevuje výraznými morfologickými defekty a sklonem k lyzi. Prokázali jsme, že následné vyrovnání koncentrace induktoru v médiu na koncentraci odpovídající kontrolnímu vzorku komplementuje projevy úbytku GlmM. Tyto výsledky dokazují esencialitu glmM pro životaschopnost S. pneumoniae. Dále jsme analyzovali, zda je pro funkčnost GlmM esenciální fosforylace na klíčových aminokyselinových zbytcích S99 a S101. Cílenou mutagenezí jsme připravili čtyři varianty plazmidů nesoucích glmM kódující záměny serinových zbytků za alanin nebo kyselinu glutamovou a transformovali je za vzniku čtyř merodiploidních kmenů, v...
|
|
|
Význam detekce regulačních T lymfocytů a rozdíly v expresi nádorových antigenů u ovariálního karcinomu
Kloudová, Kamila ; Sojka, Luděk (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Regulační T lymfocyty (Treg) hrají klíčovou roli v udržování imunitní tolerance. Potlačují vznik autoimunitních onemocnění a přispívají k udržení homeostázy imunitního systému. Expanze a nadměrná schopnost regulačních T lymfocytů tlumit imunitní reakci je ve zvýšené míře pozorována také u řady nádorových onemocnění. Dochází k inhibici protinádorové imunitní odpovědi a regulační T lymfocyty tedy přispívají k progresi nádorového onemocnění. Možnost specifické detekce regulačních T lymfocytů na základě jejich fenotypu a analýza jejich funkčních vlastností by mohla přispět k monitorování dynamiky jejich počtu a případně sloužit k přesnějšímu monitorování a nastavení protinádorové imunoterapie. Nádorové buňky exprimují řadu tzv. nádorových antigenů, které mohou sloužit jako cíl protinádorové imunitní odpovědi. Pro racionální úvahy o relevanci jednotlivých nádorových antigenů pro využití v protinádorové imunoterapii je důležité získat informaci o jejich expresi nejen na dostupných nádorových liniích, ale i na primárních nádorových buňkách izolovaných během chirurgických výkonů. V první části této práce jsem se zabývala kvantitativní analýzou regulačních T lymfocytů v nádorové tkáni a periferní krvi u pacientek s ovariálním karcinomem pomocí nově zavedené metody metyl-senzitivní kvantitativní PCR...
|
|
|
Diferenciace kolonií Saccharomyces cerevisiae
Čáp, Michal
Kvasinkové kolonie jsou, podobně jako bakteriální biofilmy, mnohobuněčnou strukturou tvořenou jednobuněčnými organismy. Tato společenstva mají svá specifika a v mnoha ohledech se liší od planktonních populací. Dochází zde k vytváření gradientů živin a metabolitů, což poskytuje základ pro buněčnou diferenciaci na rozdílné subpopulace. Přehled současných znalostí na toto téma s důrazem na kvasinkové biofilmy a kolonie je učiněn v Literárním úvodu této práce. Ve výsledkové části se pak věnuji diferenciací kolonií kvasinky Saccharomyces cerevisiae, jako modelové mnohobuněčné mikrobiální struktury. Zabývám se zde hlubší charakterizací dříve popsané horizontální diferenciace, tj. diferenciace mezi středem a okrajem kolonie, a její vztah k amoniakové signalizaci a stresové rezistenci. Zaměřil jsem se na studium významu genů stresové rezistence, jako předpokládaného významného faktoru pro přežití kolonií, pro vývoj a diferenciaci kolonií. Výsledky poněkud překvapivě ukazují na to, že stresová rezistence sama o sobě není zásadní pro přežití a diferenciaci kolonie, pro tu jsou spíše důležité změny vyvolané amoniakovou signalizací. Druhým typem diferenciace v kolonii je vertikální diferenciace na horní a dolní vrstvu popsaná v této práci. Buňky v horní a spodní vrstvě kolonie se výrazně liší morfologií,...
|
|
|
Translational control in immune response.
Hlaváček, Adam ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Imunitní reakce často vyžaduje rychlé změny v expresi genů, které mění fyziologii daných buněk. Množství článků dokládajících rozhodující vliv translační kontroly v tomto aspektu biologie buňky roste. Cílem této práce je poukázat na některé buněčné a molekulární mechanismy, které spojují translační kontrolu a imunitní reakce v buňkách imunitního systému, ale také ostatních somatických buňkách a popřípadě mohou být zneužívány některými viry. Řada imunologicky významných kontrolních mechanismů vykazuje podobnost s mechanizmy účastnícími se odpovědi na stress. V minulých letech bylo doloženo, že T buňky, dendrocyty, přirození zabíječi (z angl. natural killer) a makrofágy využívajítranslační kontrolu jako součásti aktivace imunitních buněk následující po stimulaci. Kombinace obecných a genově-specifických mechanismů translační kontroly umožňuje rychlé změny v proteomu a fyziologii, které jsou charakteristické pro aktivaci imunitních buněk. Celkový účínek translační kontroly na imunitní odpověď je dale dokreslen tím, že se podílí na všech fázích aktivace imunitní buňky - vlastní aktivaci, přežití a smrti buňky. Také translační kontrola v ne-imunitních buňkách je významná s ohledem na imunitu, protože tyto buňky mají schopnost ovlivňovat celkovou imunitní odpověď. Například fibroblasty a endotelialní buňky mění v...
|
|
|
Vlastnosti a funkce středního T antigenu myšího polyomaviru
Fabiánová, Anna ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Polyomaviry jsou malé DNA viry, které jsou schopné indukovat širokou škálu nádorů. U myšího polyomaviru (MPyV) se v indukci nádorové transformace uplatňuje zejména střední T antigen (MT antigen). MT antigen nemá vlastní enzymatickou aktivitu. Jeho funkce spočívá v aktivaci drah signální transdukce buňky, díky jeho schopnosti interagovat s určitými buněčnými proteiny. K těmto proteinům patří například protein fosfatáza 2A (PP2A), Src kináza, fosfatidyl inositol 3 kináza (PI3K), protein Shc, 14-3-3 protein nebo fosfolipáza Cγ1 (PLCγ1). Tato práce je zaměřena na interakci MT antigenu s těmito buněčnými proteiny a na dopad této interakce na transformaci buněk. Protože je MT antigen silným onkogenem, práce se zabývá i charakterem transformovaných buněk a vývojem nádoru v epitelu mléčné žlázy myši. Klíčová slova: polyomaviry, MT antigen, PP2A, PI3K, PLCγ1, protein Shc, protein 14-3-3 protein
|
|
|
Diferenciace kolonií Saccharomyces cerevisiae
Čáp, Michal ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Pichová, Iva (oponent) ; Demnerová, Kateřina (oponent)
Kvasinkové kolonie jsou, podobně jako bakteriální biofilmy, mnohobuněčnou strukturou tvořenou jednobuněčnými organismy. Tato společenstva mají svá specifika a v mnoha ohledech se liší od planktonních populací. Dochází zde k vytváření gradientů živin a metabolitů, což poskytuje základ pro buněčnou diferenciaci na rozdílné subpopulace. Přehled současných znalostí na toto téma s důrazem na kvasinkové biofilmy a kolonie je učiněn v Literárním úvodu této práce. Ve výsledkové části se pak věnuji diferenciací kolonií kvasinky Saccharomyces cerevisiae, jako modelové mnohobuněčné mikrobiální struktury. Zabývám se zde hlubší charakterizací dříve popsané horizontální diferenciace, tj. diferenciace mezi středem a okrajem kolonie, a její vztah k amoniakové signalizaci a stresové rezistenci. Zaměřil jsem se na studium významu genů stresové rezistence, jako předpokládaného významného faktoru pro přežití kolonií, pro vývoj a diferenciaci kolonií. Výsledky poněkud překvapivě ukazují na to, že stresová rezistence sama o sobě není zásadní pro přežití a diferenciaci kolonie, pro tu jsou spíše důležité změny vyvolané amoniakovou signalizací. Druhým typem diferenciace v kolonii je vertikální diferenciace na horní a dolní vrstvu popsaná v této práci. Buňky v horní a spodní vrstvě kolonie se výrazně liší morfologií,...
|
|
|
Výskyt a molekulární typizace kmenů Clostridium difficile v České republice
Malinová, Anna ; Jirásková, Alena (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Clostridium difficile je významným původcem nemocničních střevních infekcí. Souhrnně jsou onemocnění způsobená C. difficile označována jako CDAD (Clostridium difficile associated disease) a v posledním desetiletí je pozorován celosvětový nárůst jejich výskytu a závažnosti. Přesto jsou údaje o výskytu CDAD v České republice značně omezené. Hlavním cílem této práce bylo pomocí metod PCR toxinotypizace, PCR ribotypizace a MLVA (multilocus variable number tandem repeat analysis) charakterizovat kmeny C. difficile, které byly izolovány od pacientů s gastrointestinální symptomatologií hospitalizovaných ve 4 pražských zdravotnických zařízeních v letech 2008 - 2011. Mezi 273 izoláty C. difficile jsme identifikovali 8 toxinotypů (0, III, IV, V, VI, VIII, IX a XXIII) a 63 ribotypů. Nejčastějšími byly ribotypy 596 (23,4 %), 017 (13,9 %) a 176 (7 %). Z hlediska zastoupení ribotypů se situace v České republice nejvíce podobá situaci v Polsku. Pomocí metody MLVA jsme kmeny patřící do ribotypů 017, 017/1 a 017/2 a ribotypů 596 a 596/1 zařadili do 5 a 4 klonálních skupin, žádná ze skupin ovšem neměla dominantní zastoupení v některé z nemocnic. C. difficile je také významný zvířecí patogen, proto jsme provedli studii, jejímž cílem bylo izolovat C. difficile ze stolice selat na náhodně vybrané farmě. C. difficile se nám...
|
host ::
RSS.