|
|
Produkce a purifikace izoforem proteinu p53 v bakteriálním expresním systému
Vadovičová, Natália ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Protein p53 není jediným proteinem, který je kódován tumor-supresorovým genem TP53. Alternativním sestřihem, alternativním použitím promotoru a alternativními počátky translace může dojít k expresi až jedenáct dalších izoforem. Tyto izoformy byly ve zvýšeném množství pozorovány v nádorových tkáních. Jelikož jsou izoformy proteinu p53 sekvenčně, a tedy i strukturně odlišné oproti proteinu p53, mění se tím i jejich vazebné vlastnosti a funkce v buňce. Izoformy modulují funkci samotného proteinu p53, některé podporují jeho tumor-supresorovou funkci, jiné ji naopak potlačují. Objasnění mechanismu působení izoforem na děje v buňce by mohlo být využito k cílenému alternativnímu sestřihu vhodných izoforem a v léčbě rakoviny pomocí terapie založené na proteinu p53. Teoretická část diplomové práce shrnuje základní poznatky o proteinu p53 a o jeho izoformách, doplněné o výsledky výzkumů z posledních let týkajících se těchto izoforem. Dále je probrána použitá metoda, Gateway klonování. Cílem experimentální části práce byla produkce izoforem v bakteriálním expresním systému. Produkci předcházela příprava DNA sekvencí těchto dvanácti izoforem pomocí PCR a Gateway klonování. Klonováním bylo připraveno celkem dvanáct entry klonů obsahujících sekvence všech izoforem a také osm expresních klonů. Zároveň byly izolací získány a pomocí SDS-PAGE a Westernového přenosu ověřeny čtyři izoformy proteinu p53, a to p53, 40p53, 40p53 a 40p53. U izoforem budou v rámci navazujícího výzkumu testovány jejich DNA vazebné vlastnosti.
|
|
|
Optimalizace izolace plazmidové DNA pomocí magnetických částic
Chlopková, Barbora ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Teoretická část práce shrnuje poznatky ohledně izolace a přečištění plasmidové DNA a nukleových kyselin jako takových. Plasmidová DNA se používá často v genovém inženýrství jako vektor pro přenos určitého genu do buňky. Její izolace a přečištění v dostatečné kvalitě je klíčovou pro další procesy s tímto spjaté. V experimentální části byla zkoumána izolace a přečištění pDNA pomocí magnetických nosičů v přítomnosti různých koncentrací PEG 8000 v kombinaci s 1M NaCl. Dále byla zkoumána izolace pDNA pomocí komerčních kitů.
|
|
|
Preparation and expression of p53 protein isoforms using the GATEWAY expression system
Wikarská, Monika ; Hrstka, Miroslav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The TP53 gene can express protein p53 and 11 another isoform proteins N- and/or C-terminally truncated by using two promoters and alternative splicing. The p53 isoforms are found in both healthy and tumorous tissues, and are intensively studied in relation to cancer diagnosis, prognosis and treatment. In this work, the p53 isoforms were subcloned into expression vectors by LR reaction adapted from Gateway cloning system. The expression vectors were designed for protein production by bacteria E. coli strain BL-21. The constructs containing p53 isoforms were encoded together with two fusion proteins, glutathione-S-transferase and polyhistidine tag under the control of the same promotor for the affinity chromatography protein isolation. All the clones underwent Sanger sequencing for verification after homologous recombination. Sequencing confirmed the accuracy of the subcloned isoforms p53, 133p53, 160p53, p53 and 160p53 into an expression vector pDEST15-N6xHis-GST-GW-DEST. Protein 160p53 was expressed in BL-21 and isolated using both HIS and GST tag interacion. Isolation using HIS tag yielded in a higher protein concentration then the isolation mediated by the interaction of the glutathione-S-transferase.
|
|
|
Vliv přírodních a syntetických ligandů G4 na transaktivaci p53
Perná, Kristýna ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V promotorech lidských genů se vyskytují sekundární struktury DNA, jako jsou například G-kvadruplexy. Dysfunkce těchto kvadruplexových struktur byly pozorovány u několika případů nádorových onemocnění, a proto jsou tyto struktury předmětem výzkumu pro návrh nových protinádorových léčiv. Protein p53 je důležitým regulačním proteinem v procesu řízení buněčného cyklu a opravy DNA. Mutace v genu kódující tento protein se objevují u více než 50 % případů onkologických onemocnění. V této práci byl zkoumán vliv přírodních ligandů, vázající se na G-kvadruplexy, na vazbu a aktivitu proteinu p53. V teoretické části diplomové práce byla popsána struktura a vazebné vlastnosti proteinu p53, struktura a role G-kvadruplexů a byly popsány vybrané G4-ligandy vyskytující se v potravinách – kurkumin, kvercetin, berberin a kyselina ellagová. Cílem experimentální části této práce bylo zjistit vliv těchto látek na transaktivační aktivitu proteinu p53 in vivo na základě jejich interakce s G-kvadruplexy pomocí kvasinkových izogenních systémů. Interakce mezi vybranými G-kvadruplexovými strukturami a ligandy byla nejprve ověřena in vitro pomocí ThT testu a cirkulárního dichroismu.
|
|
|
Molekulárně biologická charakterizace vybraných producentů PHA
Kubáčková, Eliška ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá molekulárně biologickou charakterizací vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). V rámci práce byly pomocí molekulárně biologických metod identifikovány a charakterizovány PHA produkující termofilní izoláty pocházející ze vzorků aktivovaného kalu a kompostu. Sekvenací 16S rRNA genu byly termofilní izoláty identifikovány a taxonomicky zařazeny do kmene bakterií Firmicutes. U těchto bakteriálních izolátů byla stanovena schopnost produkce PHA na úrovni genotypu pomocí konvenční PCR detekcí phaC genu kódujícího PHA syntázu, který je klíčovým enzymem biosyntézy PHA. U většiny izolovaných bakterií byly detekovány PHA syntázy I., II. a IV. třídy, přičemž PHA syntázy tříd I a II nejsou pro detekované rody bakterií charakteristické. Největšího zastoupení izolátů představoval druh termofilní bakterie Aneurinibacillus thermoaerophilus, u kterého byla detekována PHA syntáza IV. třídy. V druhé části diplomové práce byla zavedena metoda RT-qPCR pro studium exprese vybraných genů bakterie Cupriavidus necator H16 zapojených do metabolismu PHA. V rámci zavedení metody byla provedena optimalizace PCR detekce vybraných genů a optimalizována kvantifikace genů pomocí real-time PCR. Testovaná metoda zahrnovala kroky izolace RNA, syntézu cDNA a kvantifikaci úseků genů, u nichž byly na základě získaných dat stanoveny kritické body metody.
|
|
|
Influence of cultivation conditions on the production of recombinant proteins
Gardošová, Zuzana ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Recombinant proteins are produced by using genetic modifications. In this process is insert contained gene encoding a certain protein in a cloning vector cloned into the host organism. Recombinant proteins are expressed after the transformation of the cloning vector into a host, the host organism. The expression of recombinant proteins in bacterial cells is one of the most efficient ways to manufacture these proteins. The p53 protein is a tumor suppressor protein, the main role in cells is to react on DNA damage. Due to the reaction to various intracellular and extracellular stimuli, including DNA damage, the p53 protein shows different biological functions, including regulation of senescence, cell cycle, or apoptosis. The theoretical part of the thesis part presents the basic properties of proteins, methods of recombinant protein expression, methods of protein isolation, and characterization of p53 protein. The aim of the experimental part was to determine the effect of incubation temperature on recombinant p53 protein production. The work involves the isolation of plasmid DNA and its transformation into E. coli production cells. The produced proteins were successfully isolated and subsequently characterized by SDS-PAGE and Western Blotting.
|
|
|
Analysis of C. necator genome changes after evolutionary adaptation
Vojsovič, Matúš ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The p53 protein is a transcription factor that belongs to the group of the tumour suppressor proteins. p53 functions include cell cycle regulation, interaction with DNA, and responses to damaged DNA that may lead to apoptosis or even senescence may occur. The theoretical part summarizes the latest information about the chemical structure and functions of the protein p53 and allosteric modifications that the p53 protein may possess in cells. It also describes selected methods of isolation and characterizes proteins. The aim of the experimental part was to isolate and characterize -isoforms of the p53 protein, which were isolated from the microorganism E.coli. Protein production was preceded by preparation and transformation of plasmids into production cells. From the production cells, 4 -isoforms of p53 were isolated by affinity chromatography, due to the polyhistidine anchor that the proteins contain. The isolated proteins were subsequently characterized by SDS-PAGE and western blotting. Moreover, the transactivation potential in the yeast system was monitored by luciferase assay under conditions involving the use of various culture media, as well as expressed or coexpressed under the inducible GAL1 promoter and the constitutive GPD promoter.
|
|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
|
|
Testování viability nádorových linií buněk po působení chemických látek a chemoterapeutik
Horáčková, Lucie ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V teoretické části jsou rozebrány jednotlivé typy testů viability založené na kolorimetrických změnách roztoku. Dále jsou charakterizovány proteiny HSP, které nejsou spojovány pouze s teplotním šokem, ale projevují se také během jiných stresů, například při vystavení buňky UV záření, chladu, extrémnímu pH či těžkým kovům. Pro buňku jsou důležité, protože pomáhají vytvořit správnou konformaci proteinů, které byly poškozeny buněčným stresem. Interagují také s novými nesbalenými proteiny a zajišťují jejich správné skládání. Proteiny, které jsou molekulárními chaperony ovlivňovány se souhrnně nazývají klientské proteiny. Některé HSP se také podílejí na transportu přes membránu či degradaci. S těmito proteiny kooperují tzv. kochaperony, ty jsou u proteinů teplotního šoku důležité, protože jim pomáhají při sbalování proteinů, a to zejména tím, že katalyzují hydrolýzu ATP na ADP. Také je zde popsána cisplatina a její deriváty, včetně mechanismu působení a nežádoucích účinků. Práce byla zaměřena na zjištění cytotoxicity cisplatiny a jejích derivátů. Po navození stresových podmínek v buňce působením cytostatik byly zjištěny změny v množství proteinů teplotního šoku a kochaperonů. Pomocí konfokální mikroskopie byla zjištěna lokalizace proteinů teplotního šoku a proteinu p53 v buňce.
|
|
|
Optimalizace izolace DNA jogurtových kultur a její detekce pomocí RT-PCR
Šurková, Alice ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V rámci práce byla optimalizována izolace DNA z čistých jogurtových kultur i z jogurtových výrobků. Izolovaná DNA byla následně podrobena analýze pomocí RT-PCR. V první části práce byla vyhodnocena izolace DNA z čistých jogurtových kultur pomocí komerčního kitu jako efektivnější než izolace fenolovou extrakcí a pomocí magnetických mikročástic. K posouzení kvality a kvantity získané DNA bylo použito spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty a qPCR. Pomocí komerčního kitu pak byla získána DNA v kvalitě vhodné pro PCR celkem z deseti čistých jogurtových kultur. V druhé části práce byla provedena izolace bakteriální DNA z jogurtových výrobků pomocí komerčního kitu s předchozím promytím vzorků lyzačním roztokem. Takto byla DNA izolována ze šesti jogurtových výrobků. Dále byly z těchto výrobků zaočkováním do mléka vyrobeny dvě várky domácích jogurtů, z nichž byla izolována DNA stejným způsobem. DNA získaná z jogurtů byla podrobena RT-PCR se šesti dvojicemi primerů (V3_F a V3_R, V6_F a V6_R, V1_F a V1_R, GroHRM_F a GroHRM_R, UPF a UPR, P1V1 a P2V1) a s DNA z čistých kultur jako pozitivními kontrolami. Z výsledků byla potvrzena přítomnost deklarovaných kultur v jednotlivých jogurtech a jejich schopnost množit se i po zaočkování do nového média (mléka).
|
host ::
RSS.