|
|
Concentration-dependent topology of telomere DNA quadruplexes
Bokach, Anton ; Římal, Václav (vedoucí práce) ; Štěpánek, Josef (oponent)
Telomery obsahují opakující se sekvence DNA a hrají klíčovou roli při stárnutí buněk a rakovině. Lidská telomerní DNA obsahuje sekvence bohaté na guanin, jako je (GGGTTA) n, které jsou schopné sestavit čtyřvláknové kvadruplexní struktury. Kvadruplexy mohou zaujimat různé topologie v závislosti na iontovém prostředí, koncentraci, teplotní historii a dalších faktorech. Tyto topologie zahrnují paralelní, antiparalelní a hybridní (3 + 1) typy. Zkoumali jsme účinek ředění a annealingu dvou lidských telomerních sekvencí (21 a 22 nukleotidů dlouhých) v roztoku obsahujícím draselné kationty metodami nukleární mag- netické rezonance (NMR) a Ramanovy spektroskopie. Zjistili jsme, že multimolekulární komplexy s paralelní orientací řetězců DNA, které vzníkají při vysoké koncentraci DNA (≈ 10 mM), přetrvávají i po silném zředění. Jsou narušeny pouze tepelným annealingem. Navíc annealing vedl k vytvoření unimolekulárního G-kvadruplexu, který zaujímal hy- bridní (3 + 1) konformaci. Hybridní (3 + 1) konformace G-kvadruplexu je nejpop- ulovanější monomolekulární kvadruplexní struktura přítomná v roztoku, bez ohledu na koncentraci oligonukleotidů. Pozorovali jsme rozdíly mezi strukturami kvadruplexů v koncentrovaných a zředěných roztocích a také před a po anealingu. Předkládaná práce přináší nový pohled na závislost typu...
|
|
|
Termodynamika tvorby komplexů miRNA
Vacková, Anežka ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Mojzeš, Peter (oponent)
Práce se týká mikroRNA (miRNA), což jsou krátké řetězce RNA, které svou vazbou na cílovou mRNA molekulu regulují expresi genetické informace. Vzniklé komplexy miRNA a mRNA mají zpravidla podobu neúplného duplexu, kde jsou krátké úseky Watson-Crickových bázových párů přerušovány vnitřními smyčkami, nekomplementárními páry nebo výdutěmi. Obsahem práce je studium vlivu anomálních strukturních útvarů, vnitřní smyčky a výdutě, na strukturní stabilitu komplexu tvořeného miRNA označované Let7 s jejím cílovým úsekem LCS1 na mRNA lin-41 z Caenorhabditis elegans. Řešení práce spočívalo ve změření teplotních závislostí UV absorpčních spekter směsných roztoků výše uvedených RNA sekvencí a jejich mutovaných analog a v analýze spektrálních změn pomocí metody singulárního rozkladu a následným fitováním s použitím termodynamického modelu. Výsledkem jsou určené termodynamické charakteristiky komplexů a spektrální změny spojené se zvýšením teploty komplexu a s jeho rozpadem.
|
|
|
Komplexy miRNA s cílovou RNA sekvencí
Homolka, Radim ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Římal, Václav (oponent)
miRNA jsou krátké molekuly RNA post-transkripčně regulující genovou expresi prostřednictvím vazby na cílovou mRNA. Z toho pak plyne vztah miRNA k řadě fyziologických dějů a nejrůznějším onemocněním, např. některým nádorům či virovým infekcím. V této diplomové práci byly studovány teplotně indukované rozpady oligonukleotidových duplexů simulujících vazbu miRNA na příslušnou mRNA. Pro tyto účely byly využity techniky UV absorpční spektroskopie a spektroskopie Ramanova rozptylu. Měřeny byly teplotně závislé série spekter, které pak dále byly zpracovány pomocí faktorové analýzy. Záměrem bylo interpretovat stanovené hodnoty termodynamických parametrů ve vztahu ke stabilitě duplexů a vlivu vnitřních struktur v těchto komplexech. Také byla testována vhodnost použitého přístupu pro studium komplexů oligonukleotidů. Ukázalo se, že na základě faktorové analýzy teplotně závislých sérií UV spekter lze dobře určit termodynamické parametry rozpadu duplexů. Ramanova spektra jsou zatížena velkou chybou, přesto na nich lze pozorovat některé strukturní změny spojené s přechodem. Bylo zjištěno, že výduť přítomná ve studovaném komplexu snižuje flexibilitu tohoto duplexu i energetickou výhodnost jeho vzniku.
|
|
| |
|
|
Spektroskopické studium struktury a interakcí miRNA
Homolka, Radim ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Maloň, Petr (oponent)
MiRNA jsou krátké molekuly RNA post-transkripčně regulující genovou expresi prostřednictvím vazby na cílovou mRNA. V této práci byly především spektroskopickými metodami, dále pak pomocí gelové elektroforézy, charakterizovány některé strukturní vlastnosti a termodynamické parametry (teplota tání, změna entalpie ∆H a entropie ∆S při přechodu mezi jednotlivými konformacemi) oligonukleotidů simulujících komplex miRNA a mRNA. Byly měřeny teplotní závislosti UV a Ramanových spekter, výsledky zpracovány pomocí faktorové analýzy a fitem na vhodný model určeny zmíněné termodynamické parametry. Výsledky ukázaly možnosti těchto metod pro určování termodynamických a strukturních vlastností nekanonických komplexů RNA. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
In situ study of nuclear acids interactions key for gene expression and therapy based on its silencing
Špringer, Tomáš ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Brynda, Eduard (oponent) ; Vorlíčková, Michaela (oponent)
V dizertační práci studujeme nová analoga odvozená od R06 aptameru cílící na TAR vlásenku HIV viru s použitím citlivého biosensoru s povrchovými plasmony, který umožňuje sledování molekulárních interakcí v reálném čase. Vyšetřujeme sedm různých modifikací, které jsou umístěné na devíti pozicích R06 aptameru, a odhalujeme jejich použitelnost při tvorbě účinných a stálých anti-TAR oligonukleotidů. Dále zjišťujeme, které pozice jsou vhodné pro nahrazení modifikací, a zároveň interpretujeme výsledky v kontextu lokální nukleotidové geometrie a interakcí v TAR/anti-TAR komplexu. V dizertační práci dále vyvíjíme nový fluidický systém, který eliminuje disperzi vzorku a míšení vzorků, a tak umožňuje přesné sledování molekulárních interakcí na povrchu SPR čipu. Pro charakterizaci podmínek měření na povrchu oligonukleotidového čipu studujeme stínící efekt jednomocných a dvoumocných kationtů, které jsou klíčové pro interakci záporně nabitých oligonukleotidů.
|
|
|
Molecular mechanism of DNA regulatory segment recognition by MADS box family transcription factors
Profantová, Barbora ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Jelínek, Otakar (oponent) ; Manfait, Michel (oponent)
Disertační práce se zabývá fyzikálně-chemickými vlastnostmi vazebné domény MADS box transkripčních faktorů, významnými pro tvorbu komplexů s regulačním segmentem DNA obsahujícím CArG box. Studium probíhalo i na modelových oligopeptidech, vybraných kratších segmentech MADS boxu a jejich analozích s bodovou mutací. Byla využitá široká škála spektroskopických technik, jmenovitě absorpční, fluorescenční a Ramanova spektroskopie a spektroskopie cirkulárního dichroismu. Ke zpracování dat byly použity pokročilé postupy včetně multivariačních metod. Tři tyrosiny MADS boxu, nacházející se v okolí aminokyselin s různým nábojem a hydrofobicitou, byly využity jako vnitřní spektroskopické sondy. Výsledkem práce jsou charakteristiky strukturního uspořádání, flexibility a acidobasických rovnováh MADS boxu a jeho vybraných segmentů.
|
|
|
Spektroskopické studium klíčových biomolekulárních interakcí pro terapeutické aplikace modifikovaných oligonukleotidů
Kříž, Martin ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Bednárová, Lucie (oponent) ; Mašek, Vlastimil (oponent)
Název práce: Spektroskopické studium klíčových biomolekulárních interakcí pro terapeutické aplikace modifikovaných oligonukleotidů Autor: Martin Kříž Katedra / Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí disertační práce: Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Disertační práce je zaměřena na studium biomolekulárních interakcí, které mají zásadní význam pro terapeutické použití modifikovaných oligonukleotidů. Byly studovány jednak interakce nukleových kyselin, konkrétně hybridní DNA:RNA duplexy s plně komplementárními sekvencemi, ale i DNA:RNA duplexy s centrálním mismatchem. Byl vytvořen molekulární model, pomocí kterého byl studován vliv pěti různých chemických modifikací v DNA vlákně na jeho vazební schopnosti. Strukturní změny byly charakterizovány pomocí Ramanovy spektroskopie za použití přesných diferenčních i dvojitých diferenčních spekter. Tyto údaje byly doplněny o termodynamické parametry získané z křivek tání pomocí UV absorpční spektroskopie. Dále byly pomocí Ramanovy spektroskopie studovány změny v konformaci proteinu Ribonukleázy L, ke kterým dochází po navázání ligandu, kterým je v tomto případě buď přirozený nebo modifikovaný krátký oligonukleotid. Měření s Ribonukleázou L byla prováděna za pomocí speciální experimentální techniky - DCDR spektroskopie. Klíčová slova:...
|
|
|
Spektrum Ramanova rozptylu HDO
Šubr, Martin ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Procházka, Marek (oponent)
Název práce: Spektrum Ramanova rozptylu HDO Autor: Martin Šubr Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: Prof. RNDr. Josef Štěpánek, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Hlavním cílem předložené bakalářské práce je určení Ramanova spektra HDO. Takové spektrum nemůže být v kapalném stavu změřeno samostatně, avšak je možné jej určit vhodným matematickým zpracováním série naměřených spekter s různým poměrem H/D. V rámci práce jsme proměřili Ramanova spektra kapalné vody při různých molárních zlomcích lehké a těžké vody, které jsme následně zpracovali pomocí statistické metody faktorové analýzy. Odtud se již podařilo mimo známých spekter lehké a těžké vody separovat i hledané spektrum HDO. Pro fitování spektra HDO a jeho analýzu byl použit model s rovnovážnou konstantou zahrnující lineární korekci tvaru spektra vzhledem k relativnímu podílu D v kapalině. Klíčová slova: Ramanův rozptyl, lehká a těžká voda, HDO, faktorová analýza
|
|
|
Zpřesněné stanovení stability duplexů DNA pomocí UV spektroskopie
Víšová, Ivana ; Štěpánek, Josef (vedoucí práce) ; Kočišová, Eva (oponent)
Tato práce se zabývá určováním termodynamických parametrů teplotně indukovaného rozpadu duplexů DNA. Byla provedená přesná měření UV absorpčních spekter roztoků krátkých řetězců DNA se selfkomplementární sekvencí v závislosti na teplotě a pro několik různých koncentrací. Těžištěm práce jsou návrhy a porovnání různých postupů analýzy dat s cílem nalezení nejlepšího postupu pro určování velikostí změn termodynamických potenciálů. Bylo ukázáno, že kombinace faktorové analýzy a fitu termodynamických vztahů na teplotní závislosti získaných koeficientů dovoluje určit tyto parametry z měření provedeného pouze pro jednu koncentraci vzorku a to s lepší přesností, než dosud doporučovaný postup založený na určování teplot tání pro několik koncentrací.
|
host ::
RSS.