|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Study of function and molecular architecture of fungal nitrilases applicable in biocatalysis
Veselá, Alicja Barbara ; Martínková, Ludmila (vedoucí práce) ; Macek, Tomáš (oponent) ; Teisinger, Jan (oponent)
Nitrilasy jsou enzymy katalyzující hydrolýzu nitrilů na příslušné karboxylové kyseliny a amonné ionty. Tyto enzymy mohou nalézt využití v biokatalýze a bioremediaci pro vyšší nenáročnost, bezpečnost a jednoduchost takto katalyzovaných reakcí před konvenčními metodami hydrolýzy nitrilů. V této práci byly pomocí metody prohledávání databazí vybrány sekvence hypotetických fungálních nitrilas. Jako templáty posloužily aminokyselinové sekvence fungálních nitrilas již dříve charakterizovaných v naší laboratoři. Následně byly nové syntetické geny spolu se zbylými geny z naší nitrilasové knihovny exprimovány v E. coli a poté byly porovnány jejich substrátové specifity a podobnost sekvencí. Arylacetonitrilasy z hub Arthroderma benhamiae (NitAb) a Nectria haematococca (NitNh) byly purifikovány a charakterizovány; byly stanoveny jejich substrátové specifity, kinetické parametry, pH a teplotní profily a velikost podjednotek. NitAb a NitNh spolu s dalšími rekombinantními fungálními nitrilasami byly použity pro hydrolýzu vysokých koncentrací (R,S)-mandelonitrilu v jedné dávce nebo s postupným dávkováním substrátu. Ze studovaných enzymů nitrilasa z Aspergillus niger vykázala nejlepší enantioselektivitu (e.e. pro (R)-mandlovou kyselinu až 97,6 %) a produktivitu enzymu v sušině (až 40 g gsuš -1 ). NitAb byla pouze mírně...
|
|
|
Structure and biocatalytic properties of nitrilases from filamentous fungi
Křenková, Alena ; Martínková, Ludmila (vedoucí práce) ; Macek, Tomáš (oponent) ; Klempier, Norbert (oponent)
Vláknité houby jsou vedle bakterií bohatým zdrojem nitrilas využitelných pro biotechnologické účely. V databázích lze najít velké množství sekvencí domnělých nitrilas, ale jen málo těchto enzymů bylo exprimováno, purifikováno a charakterizováno. Syntetické geny nitrilas z Aspergillus niger CBS 513.88 a Neurospora crassa OR74A byly navrženy podle sekvencí uložených v databázi GenBank. Tyto geny byly exprimovány v Escherichia coli a získané nitrilasy byly purifikovány a charakterizovány. Také byla studována ko-exprese molekulárních chaperonů s nitrilasami pomocí sady komerčních chaperonových plasmidů. Pro studium strukturních vlastností nitrilas byly použity různé metody, jako je homologní modelování, analytická ultracentrifugace nebo elektronová mikroskopie. Produkce rekombinantních nitrilas byla srovnána s produkcí nativními producenty - vláknitými houbami. Vzhledem k nízké produkci enzymu těmito houbami a jejich obtížné kultivaci se ukázalo být výhodným využití prokaryotického expresního systému. Vliv aminokyselin v blízkosti katalytického cysteinu na aktivitu, chemoselektivitu a enantioselektivitu byl studován pomocí bodových mutací. Vliv určitých aminokyselin v blízkosti katalytického centra enzymu na jeho vlastnosti je podobný i u vzdáleně příbuzných nitrilas, proto je možné katalytické...
|
|
| |
host ::
RSS.