Original title: Optimalizace přípravy rekombinantního CYP3A4
Translated title: Optimization of recombinant CYP3A4 preparation
Authors: Zvolská, Eliška ; Indra, Radek (advisor) ; Martínek, Václav (referee)
Document type: Bachelor's theses
Year: 2025
Language: cze
Abstract: [cze] [eng]
Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) je nejvíce zastoupeným cytochromem P450 v lidském těle. Hraje zásadní roli v metabolismu xenobiotik, kdy se podílí na metabolismu 30 až 50 % všech klinicky využívaných léčiv. Rovněž se účastní metabolismu endogenních substrátů a roli hraje i v některých rakovinných onemocněních. Z těchto důvodů je CYP3A4 nutno získávat pro vědecké účely. Nejvíce využívanými expresními systémy pro jeho přípravu jsou bakterie, konkrétně E. coli. V této práci byl využit kmen DH5α, který byl transformován plazmidem nesoucím gen pro CYP3A4 a NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktázu (CPR). Cílem práce bylo najít vhodné podmínky exprese tohoto konstruktu. Prvním cílem bylo ověření pozitivního vlivu δ-aminolevulové kyseliny (δALA) na expresi CYP3A4 a určení optimální doby exprese. Dalším krokem pak bylo provedení expresí za čtyř různých podmínek - exprese byly provedeny při 20; 25 a 30 řC při 120 rpm a dále pak při 30 řC a 180 rpm. V rámci každé série byly testovány tři optické denzity - OD600 0,4; 0,6 a 0,8. Pro OD600 0,6 byly v rámci každé série testovány tři různé koncentrace IPTG jako induktoru - 0,1; 1 a 5mM IPTG. Pomocí sonikace a několika centrifugací byly pro každý vzorek izolovány bakteriální membrány obsahující membránově vázaný CYP3A4 a NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktázu. V membránové... Cytochrome P450 3A4 is the most abundant cytochrome in the human body. It plays a key role in the metabolism of xenobiotics, being involved in the metabolism of 30 to 50 % of all clinically used drugs. It also participates in the metabolism of endogenous substrates and is involved in certain cancerous diseases. For these reasons, it is necessary to produce CYP3A4 for scientific purposes. The most commonly used expression system for its production is bacteria, specifically E. coli. In this study, the DH5α strain was used, transformed with a plasmid carrying the genes for CYP3A4 and NADPH:cytochrome P450 oxidoreductase (CPR). The aim of this work was to identify suitable conditions for expression of this construct. The first goal was to verify the positive effect of δ-aminolevulonic acid (δALA) on CYP3A4 expression and to determine the optimal time of expression. The next step was to perform expression under four different conditions - at 20; 25; and 30 řC shaking at 120 rpm, and at 30 řC shaking at 180 rpm. For each condition, three optical densities were tested - OD600 0,4; 0,6; and 0,8. At OD600 0,6, three different IPTG concentrations were tested - 0,1; 1; and 5mM IPTG. Using sonication and several centrifugation steps, bacterial membranes containing the membrane-bound CYP3A4 and NADPH:cytochrome...
Keywords: CYP3A4; cytochrome P450; expression optimization; recombinant expression; CYP3A4; cytochrom P450; optimalizace exprese; rekombinantní exprese

Institution: Charles University Faculties (theses) (web)
Document availability information: Available in the Charles University Digital Repository.
Original record: http://hdl.handle.net/20.500.11956/199789

Permalink: http://www.nusl.cz/ntk/nusl-686028


The record appears in these collections:
Universities and colleges > Public universities > Charles University > Charles University Faculties (theses)
Academic theses (ETDs) > Bachelor's theses