Original title:
Studium souvislosti G-kvadruplexů s regulací řízenou proteinem p53
Translated title:
Study on the relation between G-quadruplexes and p53-driven regulation
Authors:
Holotová, Paulína ; Vodička, Juraj (referee) ; Brázda, Václav (advisor) Document type: Bachelor's theses
Year:
2023
Language:
eng Publisher:
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická Abstract:
[eng][cze]
Táto práca sa zaoberá úlohou štruktúr G-kvadruplexov, ich stabilizáciou pomocou ligandov a úlohou p53 v regulácii transkripcie. G-kvadruplex je typ sekundárnej štruktúry nukleovej kyseliny zloženej z 2 – 4 tetrád. Každá tetráda je tvorená štyrmi guanínmi spojenými prostredníctvom Hoogstenovho párovania báz. Táto práca pozostáva z teoretickej a experimentálnej časti. V teoretickej časti bola opísaná podstata G-kvadruplexových štruktúr a ich potenciál pri liečbe rakoviny, úloha p53 v bunkovom cykle a jeho regulácia a ligandy kurkumín a TMPyP4 použité na stabilizáciu G4. V experimentálnej časti sa študovali interakcie ligandov kurkumínu a TMPyP4 so štruktúrami nukleových kyselín. Reportérové kmene kvasiniek obsahujúce PUMA, KSHV aich kombinácie boli transformované plazmidmi kódujúcimi iba selekčné markery a plazmidmi kódujúcimi divokú formu génu pre proteín p53. V teste životaschopnosti, optimálna koncentrácia ligandov (kurkumínu a TMPyP4) bola stanovená pre reportérový kmeň PUMA, ktorá sa ďalej použila v Luciferázovom teste. Test vytesnenia fluorescenčného indikátora s tioflavínom T ako fluorescenčným farbivom dokázal interakciu medzi oligonukleotidmi tvoriacimi G4 a kurkumínom a TMPyP4. Luciferázový test sa použil na vyhodnotenie interakcie medzi transformovanými reportérovými kmeňmi kvasiniek a oboma ligandmi. Výsledky po 24 hodinách ukázali štatistickú významnosť pre každý kmeň v rovnakom prostredí, pričom kmeň PUMA vykazoval najvyššiu transaktivačnú aktivitu - insert PUMA je cieľovým génom pre p53. Kmene s PUMA aj KSHV vykazovali významne nižšiu transaktivačnú aktivitu, keďže prítomné ligandy mohli stabilizovať štruktúru G4 prítomnú v KSHV, a tým znížiť transkripciu. Prítomnosť G4 v sekvencii KSHV sa potvrdila aj pomocou programu G4Hunter, pričom G4Skóre bolo 3,182. Transaktivácia bola výrazne nižšia aj v kmeňoch PUMA prítomných v prostredí kurkumínu a TMPyP4, aj napriek tomu, že táto sekvencia netvorí G4, čo potvrdil aj program G4Hunter. To naznačuje, že študované ligandy kurkumín a TMPyP4 môžu regulovať metabolizmus buniek iným spôsobom, ako sa doteraz predpokladalo.
This thesis deals with the role of G-quadruplex structures, their stabilisation using ligands and the role of p53 in transcription regulation. G-quadruplex is a type of nucleic acid secondary structure composed of 2 – 4 tetrads. Each tetrad is formed by four guanines linked by Hoogsten base pairing. This work consisted of theoretical and experimental parts. The theoretical part described the nature of G-quadruplex structures and their potential for cancer treatment, the role of p53 in the cell cycle and its regulation, and the ligands curcumin and TMPyP4 used for G4 stabilization. In the experimental part, the interactions of the curcumin and TMPyP4 with nucleic acid structures were studied. Reporter yeast strains containing PUMA, KSHV, and their combinations were transformed with plasmids encoding only selection markers and plasmids encoding the wild type form of the gene for protein p53. In the viability assay, the optimal ligand (curcumin and TMPyP4) concentration was determined for reporter yeast strain PUMA, which was further used in Luciferase assay. A fluorescence indicator displacement assay with Thioflavin T as a fluorescence dye proved the interaction between G4-forming oligonucleotides, and curcumin and TMPyP4. Luciferase assay was used to evaluate the interaction between transformed reporter yeast strains and both ligands. The results after 24 hours showed statistical significance for each strain in the same environment, where the PUMA strain showed the highest transactivation activity: the PUMA insert is a target gene for p53. Sequences with both PUMA and KSHV showed significantly lower transactivation activity, as ligands may have stabilized the G4-structure present in KSHV and thus down- regulate transcription. The presence of G4 in the KSHV sequence was also confirmed using the G4Hunter, with a G4Score of 3.182. Transactivation was significantly lower in the PUMA strains present in curcumin and TMPyP4 environment, although this sequence was not predicted to form G4, which was also confirmed in the G4Hunter analysis. This suggests that studied ligands curcumin and TMPyP4 may regulate the cell metabolism in a different than previously predicted way.
Keywords:
FID assay; g-kvadruplex; G4Hunter; kurkumín; Luciferázová assay; p53; TMPyP4; curcumin; FID assay; g-quadruplex; G4Hunter; Luciferase assay; p53; TMPyP4
Institution: Brno University of Technology
(web)
Document availability information: Fulltext is available in the Brno University of Technology Digital Library. Original record: http://hdl.handle.net/11012/210768
guest ::
