Original title:
Vývoj nové generace bioinokulantů a studium jejich biologické aktivity
Translated title:
Development and experimental evaluation of bioactivity of the next-generation bioinnoculants
Authors:
Súkeník, Martin ; Pekař, Miloslav (referee) ; Sedláček, Petr (advisor) Document type: Master’s theses
Year:
2023
Language:
cze Publisher:
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická Abstract:
[cze][eng]
Cíl této diplomové práce spočíval v charakterizaci specifických mechanismů biologické aktivity u bakterií podporujících růst rostlin (PGPR), běžně se nacházející v rhizosféře rostlin a ve studii účinků aplikace kapalných i gelových PGPR bioinokulantů na rostliny v kontrolovaném prostředí. Pro přípravu gelových bioinokulantů na bázi těchto PGPR byl navržen originální koncept samo-enkapsulace prostřednictvím síťování alginátu přímo produkovaného v průběhu jejich biotechnologické kultivace. Ověření účinnosti tohoto konceptu vyžadovalo všechny vybrané kmeny podrobit gelačním experimentům se síťovacím činidlem CaCl2 2 % hm. za tvorby alginátového gelu. Pro přípravu a charakterizaci bioinokulantů byly vybrány tři konkrétní kmeny Azotobacter vinelandii DSM 87, DSM 720 a CCM 289. Materiálové vlastnosti vytvořených gelů byly charakterizovány metodou oscilační reometrie (amplitudovým testem). Všechny kmeny byly podrobeny gravimetrickému stanovení koncentrace alginátu i biomasy. Pro ověření viability buněk ihned po kultivaci byla použita průtoková cytometrie s fluorescenční sondou PI, DAPI a SYTOX™ Green. Dále bylo provedeno sušení gelů s pomocí lyofilizátoru, kdy lyofilizovaný gel byl použit při botnacích experimentech s následným sušením. V rámci ověření biologické aktivity bioinokulantů byla kvalitativně ověřena schopnost všech kmenů rozpouštět a utilizovat fosfáty z agarového živného média. Dále byla u všech kmenů spektrofotometricky ověřena produkce indol-3-octové kyseliny. Kvalitativně i kvantitativně byla ověřena také produkce sideroforů. Pěstební pilotní experimenty na rostlině lociky salátové (Lactuca sativa) byly provedeny s přídavkem kapalné i gelové nosičové PGPR kompozice, jako negativní kontrola byla rostlina ponechána bez přídavku nosičové PGPR kompozice. Výsledky z pilotního pěstebního experimentu prokázaly pozitivní růstový efekt gelové i kapalné PGPR kompozice na rostliny. Na konci pěstebního experimentu byla zaznamenána vyšší délka listů a kořenového systému po aplikaci obou forem PGPR do půdy, konkrétně průměrná délka listů s přídavkem gelové nosičové PGPR kompozice byla 4,3±1,0 cm, pro kapalnou nosičovou PGPR kompozici 4,3±1,2 cm, průměrná délka kořenového systému byla 18,3±5,2 cm respektive 17,4±6,0 cm. Hmotnost sušiny na jednu vypěstovanou rostlinu s přídavkem kapalné i gelové PGPR byla shodná, tedy 0,19±0,07 g. Nejvyšší obsah chlorofylu a, chlorofylu b i karotenoidů v listech byl spektrofotometricky prokázán u rostlin rostoucích s přídavkem kapalné PGPR kompozice, konkrétně chlorofylu a bylo zjištěno 6±1 µg/ml, chlorofylu b 7±2 µg/ml a karotenoidů 3,6±0,5 µg/ml. Pomocí destiček BIOLOG EcoPlate™ byla analyzována diverzita půdních mikrobiomů odebraných z půdy bez přídavku PGPR kompozice, s přídavkem kapalné PGPR kompozice a s přídavkem gelové PGPR kompozice. Diverzita mikrobiomu byla vyhodnocena pomocí průměrného vývoje barvy jamky, tedy parametru AWCD a pomocí Shannonova indexu diverzity H'. Nejvyšší utilizace nejširšího počtu uhlíkových zdrojů na destičce byla zaznamenána u půdního mikrobiomu s přídavkem gelové PGPR kompozice. Již zmíněný půdní mikrobiom také vykazoval nejvyšší hodnotu indexu H'.
This diploma thesis aimed to characterize specific mechanisms of biological activity in plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) commonly found in the rhizosphere of plants and to study the effects of liquid and gel application of PGPR bioinoculants on plants in a controlled environment. An original concept of self-encapsulation via cross-linking of alginate directly produced during their culturing was proposed for the preparation of gel bioinoculants based on these PGPRs. To validate the efficacy of this concept, all selected strains had to be subjected to gelation experiments with the crosslinking agent CaCl2 2 wt. % under alginate gel formation. Three specific strains of Azotobacter vinelandii DSM 87, DSM 720 and CCM 289 were selected for the preparation and characterization of the bioinoculants. The material properties of the formed gels were characterized by oscillatory rheometry (amplitude test). All strains were subjected to gravimetric determination of alginate and biomass concentrations. Flow cytometry with fluorescent probe PI, DAPI and SYTOX™ Green was used to verify cell viability immediately after culturing. Furthermore, the drying of gels was performed using a lyophilizer, where the lyophilized gel was used in swelling experiments followed by drying. To verify the biological activity of the bioinoculants, the ability of all strains to dissolve and utilize phosphate from the agar medium was qualitatively verified. Furthermore, the production of indole-3-acetic acid was spectrophotometrically verified for all strains. The production of siderophores was also verified qualitatively and quantitatively. Cultivation pilot experiments on the lettuce (Lactuca sativa) plant were performed with the addition of both liquid and gel carrier PGPR compositions; as a negative control, the plant was left without the addition of carrier PGPR composition. The results from the pilot growth experiment showed a positive growth effect of both gel and liquid PGPR composition on the plants. At the end of the growing experiment, higher leaf and root system lengths were recorded after the application of both forms of PGPR to the soil, specifically, the average leaf length with the addition of gel carrier PGPR composition was 4.3±1.0 cm and 4.3±1.2 cm for the gel carrier PGPR composition, and the average root system length was 18.3±5.2 cm and 17.4±6.0 cm, respectively. The dry weight per plant grown with the addition of liquid and gel PGPR was the same 0.19±0.07 g. The highest content of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids in the leaves was spectrophotometrically detected in plants grown with the addition of liquid PGPR composition, specifically chlorophyll a was found to be 6±1 µg/ml, chlorophyll b 7±2 µg/ml and carotenoids 3.6±0.5 µg/ml. The diversity of soil microbiomes collected from the soil without the addition of PGPR composition, with the addition of liquid PGPR composition and with the addition of gel PGPR composition was analysed using BIOLOG EcoPlate™ plates. The diversity of the microbiome was evaluated using the average well colour development, i.e., the AWCD parameter, and the Shannon diversity index, H'. The highest utilization of the widest number of carbon sources on the plate was recorded for the soil microbiome with the addition of the gel PGPR composition. The aforementioned soil microbiome also showed the highest value of the H' index.
Keywords:
Alginate; Azotobacter vinelandii; PGP mechanisms; PGPB; PGPR; polyhydroxyalkanoates; Alginát; Azotobacter vinelandii; PGP mechanismy; PGPB; PGPR; polyhydroxyalkanoáty
Institution: Brno University of Technology
(web)
Document availability information: Fulltext is available in the Brno University of Technology Digital Library. Original record: http://hdl.handle.net/11012/209672
guest ::
