Original title:
Vývoj systému pro digitální PCR
Translated title:
Digital PCR development
Authors:
Gaňová, Martina ; Lipov,, Jan (referee) ; Jansová,, Eva (referee) ; Neužil, Pavel (advisor) Document type: Doctoral theses
Year:
2022
Language:
eng Publisher:
Vysoké učení technické v Brně. CEITEC VUT Abstract:
[eng][cze]
Mikrotechnologické a nanotechnologické metody se v posledních letech ukázaly jako účinný nástroj pro analýzu deoxyribonukleové kyseliny (DNA). Různé techniky vyvinuté k amplifikaci nukleových kyselin (NK) byli publikovány v posledním desetiletí, včetně mikrofluidních systémů. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je v molekulární biologii široce používána k amplifikaci cílové NK in vitro. Počet skupin pracujících s PCR po celém světě je obrovský vzhledem k důležitému sociálnímu a ekonomickému dopadu této techniky, například v oblasti lékařské diagnostiky, kriminalistiky, zpracování potravin nebo environmentálních studií. V současné době pandemie koronavirového onemocnění 2019 se prokázala důležitost vývoje přístupnějších technologií pro diagnostiku virových onemocnění. Disertační práce popisuje vývoj dvou verzí platforem PCR pro detekci NK, kapkovou kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) a digitální PCR (dPCR). Klíčové komponenty obou platforem byly vyrobeny pomocí mikrotechnologických postupů pro úpravu povrchů a litografickou výrobu umožňující vývoj hydrofobních krycích skel nebo křemíkových mikročipů. Výsledky práce demonstrují návrh, sestavení a testování včetně optimalizace obou platforem. Technologie PCR je tvořena softwarovou částí, ovládanou programem LabView a hardwarovou častí sestávající ze systému řízení teploty a zobrazovacího systém florescence. Kapková qPCR byla prováděna v 0.3 µL kapky směsi obsahující cílový gen napipetovaný v objemu 2 µL kapky minerálního oleje. Kapky byly pipetovány na hydrofobní krycí sklo, které bylo umístěno na termoelektrický chladič (TEC) pod fluorescenční mikroskop, aby se provedlo teplotní cyklování. Změny fluorescence během cyklů byly zachyceny fotonásobičem a sledovány osciloskopem. Výsledky testování popisují také schopnost multiplexování vyvinuté techniky. V práci je představená amplifikace tří syntetických genů s využitím interkalačního fluorescenčního barviva pro simultánní detekci a kvantifikaci na základě jednoho fluorescenčního kanálu. Kapková technologie qPCR byla zásadní platformou pro další vývoj platformy dPCR. Platforma dPCR používá křemíkový mikročip s disperzí vzorku do mikrojamek o celkovém počtu 26 448, každá s průměrem 50 µm a objemem 59 pL. Mikročip naplněn vzorkem byl pokryt minerálním olejem a krycím sklem modifikovaným polydimethylsiloxanem a Parylenem C. Systém ohřevu/chlazení teplotního cyklování s TEC byl podobný jako u kapkové platformy qPCR. Fluorescenční zobrazovací systém používal k zachycení fluorescenčních obrazů polovodičovou kameru na bázi CMOS. Vyvinutá dPCR byla testována pro aplikace ve výzkumu humánní medicíny. Testovací vzorky DNA byly část syntetického genu viru, izolovaná genomická DNA viru a izolovaná genomická DNA ženy. Disertační práce popisuje vývoj systému dPCR, který je součástí nové techniky dPCR, která je cenově dostupnější a snadno použitelná s jednoduchým dávkováním vzorků, což jsou nejčastější problémy, proč si zatím mezi laboratořemi nenašla velkou popularitu. dPCR mikročip na bázi křemíku zlepšil výkon systému díky velkému počtu mikrojamek. Využití technologie dPCR vyniká ve vysoké citlivosti, v nízkém poměru signálu k šumu, dosahované přesnosti, v nízkém detekčním limitu a schopnosti multiplexování.
In recent years, microtechnological and nanotechnological methods have proven to be a powerful analytical tools for deoxyribonucleic acid (DNA) analysis. There are reviewed different techniques developed over the last decade to amplify the nucleic acids (NA), including microfluidic systems. Polymerase chain reaction (PCR) is widely used in molecular biology to amplify target NA in vitro. The number of groups working on PCR worldwide is significant given the substantial social and economic impact of this technique, for example, in medical diagnostic, criminology, food processing, or environmental studies. Nowadays, the coronavirus disease 2019 pandemic proved the importance of developing more accessible technologies for diagnosing viral diseases. The thesis presents the development of two versions of PCR platforms for NA detection, droplet real-time quantitative PCR (qPCR) and digital PCR (dPCR). The critical components of both platforms were fabricated using the microtechnological procedures for surfaces modification and lithographic fabrication, allowing the development of hydrophobic cover glasses or silicon microchips. The results of the thesis demonstrate the design, assembly, and testing with optimization of both platforms. The PCR technology consists of a software part controlled by the LabView program and a hardware part consisting of a temperature control system and a fluorescence imaging system. The droplet qPCR was conducted in 0.3 µL of the master mix droplet containing the target gene encapsulated with 2 µL of mineral oil. The droplets were pipetted on the hydrophobic cover glass, placed on the thermoelectric cooler (TEC) under the fluorescence microscope to conduct thermal cycling. The fluorescence changes during thermal cycling were captured by photomultiplier tubes and monitored by oscilloscope. The results of the testing also present the multiplexing capability of the developed technique. Three synthetic genes using intercalating fluorescent dye for simultaneous detection and quantification based on a single fluorescence channel were introduced. The droplet qPCR technology was a crucial platform for further development of the dPCR platform. The dPCR platform employed a silicon microchip with microwell sample dispersion to the 26 448 microwells, each with a target diameter of 50 µm and a volume of 59 pL. The microchip loaded with the master mix containing the target DNA was covered by the mineral oil and cover glass modified by polydimethylsiloxane and Parylene C. The heating/cooling system of thermal cycling with the TEC was similar to the droplet qPCR platform. The fluorescent imaging system used a complementary metal-oxide-semiconductor (known as CMOS) camera to capture the fluorescent images. The developed dPCR was demonstrated for applications in human medical research. The synthetic virus DNA, isolated virus DNA, and female genomic DNA were tested. The thesis reveals the development of the dPCR system, which is a part of a new dPCR technique that is more affordable, easy to use with simple sample delivery, which are the most common problems why it has not yet found much popularity among laboratories. The silicon-based microchip dPCR improved the system performance due to a large number of wells. The employment of such dPCR benefits of high sensitivity, low signal to noise ratio, accuracy or lower detection limit, and multiplexing capability.
Keywords:
amplifikace DNA; analýza křivky tání.; analýza nukleových kyselin; detekce fluorescence; dPCR; Kapková qPCR; mikrotechnologie; teplotní cyklování; DNA amplification; dPCR; Droplet qPCR; fluorescence detection; melting curve analysis.; microtechnology; nucleic acids analysis; thermal cycling
Institution: Brno University of Technology
(web)
Document availability information: Fulltext is available in the Brno University of Technology Digital Library. Original record: http://hdl.handle.net/11012/208448
guest ::
