Original title:
Využití molekulárních technik k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia
Translated title:
Use of molecular techniques to characterize yeasts of the genus Metschnikowia
Authors:
Schneiderwindová, Nicole ; Brázda, Václav (referee) ; Němcová, Andrea (advisor) Document type: Master’s theses
Year:
2022
Language:
cze Publisher:
Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická Abstract:
[cze][eng]
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi provedení a využití molekulárních metod k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia a také aplikací metod v biotechnologiích případně v potravinářském průmyslu. V teoretické části je zaměřená na stručný popis kvasinek, zejména vybraných druhů, které se používaly během praktické části, možnosti jejich využití, a především na detailní popis všech použitých molekulárních technik. V praktické části se zaměřuje na optimalizaci použitých molekulárních metod, konkrétně metody pulzní gelové elektroforézy (PFGE) a metody denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE). Na začátku byla provedena kultivace kvasinek za optimálních podmínek, které jsou pro tento rod specifické. Dále byla pomocí izolačních technik izolována jejich DNA, která byla následně podrobena zpracování pomocí metod PFGE a PCR–DGGE. Nejvíce bylo třeba optimalizovat postup izolace DNA. Bylo provedeno několik optimalizací koncentrace lyzačních enzymů, zejména pak enzymu lytikázy. Také bylo potřeba stanovit správný poměr low-melting agarosy a izolované DNA, což bylo zásadní pro správnou konzistenci izolovaných DNA bločků a pro jejich další uplatnění při PFGE analýze. Nakonec byla provedena optimalizace metody PFGE, která přinesla správné rozdělení chromozomů, díky čemuž bylo možné jednotlivé chromozomy popsat dle jejich velikosti podle použitého standardu CHEF kvasinky Hansenula wingei. Pro správnou optimalizaci samotného procesu DGGE analýzy bylo třeba nejdříve izolovat kvasinkovou DNA pomocí kitu, tato DNA byla následně použita jako templát pro PCR reakci. Byla optimalizována také teplota annealingu pro jednotlivé skupiny použitých primerů. Amplikony, které byly získány pomocí této reakce byly separovány pomocí metody DGGE. U této techniky bylo zapotřebí především optimalizace základních parametrů jako je rozsah denaturačního gradientu či celkový čas separace. Dle výsledků měření lze určit, že postup izolace DNA kvasinek a jejich následná analýza pomocí molekulárních metod pulzní gelové elektroforézy a denaturační gradientové gelové elektroforézy byla úspěšná. Podařilo se nám alespoň částečně popsat genom a určit počet chromozomů u všech použitých druhů kvasinek rodu Metschnikowia.
This diploma thesis deals with the possibilities of implementation and use of molecular methods for the characterization of yeasts of the genus Metschnikowia and the application of methods in biotechnology or the food industry. The theoretical part focuses on a brief description of yeast, specially selected species that were used during the practical part of the work, the possibilities of their use, and especially on a detailed description of all molecular techniques used. The practical part focuses on the optimization of the molecular methods, namely the method of pulsed gel electrophoresis and the method of denaturing gradient gel electrophoresis. Initially, yeast was cultured under optimal conditions that are specific to this genus. Furthermore, their DNA was isolated using isolation techniques, which were subsequently processed using PFGE and PCR–DGGE methods. The DNA isolation procedure needed to be optimized the most. Several optimizations of the concentration of lysis enzymes, especially the lyticase enzyme, were performed. It was also necessary to determine the correct ratio of low-melting agarose and isolated DNA, which was essential for the correct consistency of the isolated DNA blocks and their further application in PFGE analysis. Finally, the PFGE method was optimized, which brought the correct distribution of chromosomes, and it was possible to describe the individual chromosomes according to their size according to the standard used CHEF of the yeast Hansenula wingei. To properly optimize the DGGE analysis process itself, it was first necessary to isolate the yeast DNA using a kit, then it was used as a template for the PCR reaction. The annealing temperature was also optimized for the individual groups of primers. The amplicons obtained by this reaction were separated by the DGGE method. This technique mainly required the optimization of basic parameters such as the range of the denaturation gradient or the total separation time. According to the measurement results, it can be determined that the process of yeast DNA isolation and their subsequent analysis using molecular methods of pulsed gel electrophoresis and denaturing gradient gel electrophoresis was successful. We were able to describe the genome and determine the number of chromosomes in all used yeast species of the genus Metschnikowia at least partially.
Keywords:
biotechnology; DGGE; DNA; Metschnikowia; PCR; PFGE; Yeast; biotechnologie; DGGE; DNA; Kvasinky; Metschnikowia; PCR; PFGE
Institution: Brno University of Technology
(web)
Document availability information: Fulltext is available in the Brno University of Technology Digital Library. Original record: http://hdl.handle.net/11012/204328
guest ::
