Original title:
Konštrukcia a charakterizácia mutantných foriem cytokinínového receptora CRE1 AHK4 z Arabidopsis thaliana
Authors:
Pacurová, Marika Document type: Bachelor's theses
Year:
2018
Language:
slo Abstract:
[cze][eng] Rostlinný receptor CRE1 / AHK4 vytváří po navázání cytokininů signál, který je následně přenášený do jádra buňky, kde reguluje transkripci cílových genů. Pro studium aktivity receptoru a jeho mutantních forem se využívá skutečnosti, že receptor zachovává svou aktivitu i po expresi v kmeni KMI001 bakterie Escherichia coli, kdy je detekovaná aktivita β-galaktozidázy jako odpověď na cytokininy. Práce ,,Konstrukce a charakterizace mutantních forem cytokininového receptoru CRE1/AHK4 z Arabidopsis thaliana“ rozebírá problematiku mutageneze vykonané pomocí komerčně dostupného kitu a postupu popsaného v odborné literatuře. Současně charakterizuje receptor AHK4, popisuje jeho signální dráhu po expresi v bakteriálním kmeni KMI001 a shrnuje také jeho popsané mutantní formy. Experimentální část se zaměřuje na PCR mutagenezi vykonanou dvěma popsanými způsoby včetně návrhu primerů zanášejících mutaci a transformaci mutovaného konstruktu do Escherichia coli KMI001. Dále se zaměřuje na samotný test β-galaktosidázové aktivity mutantních variant CRE1 / AHK4 v přítomnosti koncentrační řady hormonu trans-zeatinu. Výsledky ukazují, že mutace L437F, L437G, L437I, L437W a L437Y způsobují při nízkých koncentracích trans-zeatinu zvýšenou míru aktivity vůči původní nemutované formě CRE1 / AHK4 receptoru, avšak přítomnost mutace L437H způsobila ztrátu této aktivity.The CRE1 / AHK4 plant receptor produces after cytokinin binding a signal transferred to the cell nucleus where it regulates the transcription of target genes. The functionality of the receptor is retained after expression in the Escherichia coli KMI001 which is then used for the study of the receptor, where ß-galactosidase activity is detected in response to cytokinins. The "Construction and Characterization of Arabidopsis thaliana CRE1 / AHK4 Cytokinin Receptor Mutant Forms" describes the principle of mutagene-sis of a commercially available kit and approach published in the literature, summarizes the function of the AHK4 receptor, describes its signal pathway after expression in the bacterial strain KMI001 and characterizes its mutant forms. The experimental part focuses on the PCR mutagenesis carried out by the two methods including the design of mutagenic primers containing the desired mutation and performing the transformation of the mutant construct into Escherichia coli strain KMI001, as well as the β-galactosidase activity test of the mutant variants CRE1 / AHK4 receptor in the presence of the trans-zeatin hormone concentrations. The results indicate that mutations L437F, L437G, L437I, L437W and L437Y cause increased activity at low level of the trans-zeatin concentrations compared to wild-type CRE1 / AHK4 receptor, but the effect of the L437H mutation causes loss of this activity.
Keywords:
AHK4; galaktosidázová aktivita; kmen KMI001 Escherichia coli; PCR mutageneze; trans-zeatin
guest ::
