Original title:
Příprava vazebných partnerů 14-3-3 proteinů pro strukturní studie.
Translated title:
Preparation of the 14-3-3 Protein Binding Partners for Structural Studies.
Authors:
Kopecká, Miroslava ; Obšil, Tomáš (advisor) ; Teisinger, Jan (referee) Document type: Master’s theses
Year:
2011
Language:
cze Abstract:
[cze][eng] Tyrosinhydroxylasa patří do skupiny hydroxylas aromatických aminokyselin a katalyzuje počáteční krok biosyntézy katecholaminových neuropřenašečů. Tento enzym má homoteramerní strukturu a skládá se ze tří strukturních domén: N-koncové regulační domény, katalytické domény a C-koncové tetramerizační domény. Aktivita tyrosinhydroxylasy je regulována fosforylací a regulací na úrovni exprese. Fosforylace Ser-19 umožňuje navázání proteinu 14-3-3, které ovlivňuje strukturu regulační domény a chrání ji před její defosforylací a degradací. Struktura regulační domény je stále neznámá, proto jsme se rozhodli pro její objasnění pomocí technik nukleární magnetické rezonance. Byl optimalizován expresní a purifikační protokol regulační domény tyrosinhydroxylasy. Protein byl exprimován jako fúzní protein obsahující histidinovou kotvu na N-konci polypetidového řetězce. Purifikace se skládala ze dvou kroků: z niklové chelatační chromatografie a gelové permeační chromatografie. Dynamický rozptyl světla a 1 H-NMR spektroskopie byly využity k ověření monodisperzity proteinu a jeho možného použití pro další experimenty.Tyrosine hydroxylase belongs to the group of hydroxylases of aromatic acids and catalyzes a key step in the biosynthesis of catecholamine neurotransmitters. The tyrosine hydroxylase possesses the homotetrameric structure and contains three structural domains: the N-terminal regulatory domain, the catalytic domain and the C-terminal tetramerization domain. The activity of tyrosine hydroxylase is regulated by phosphorylation and through the regulation of its expression. Phosphorylation at Ser-19 induces binding of the 14-3-3 protein, which affects the structure of the regulatory domain and protects it against both dephosphorylation and degradation. Since the structure of the regulatory domain is still unknown, we decided to perform its structural characterization using NMR techniques. First, the expression and purification protocol of the regulatory domain of tyrosine hydroxylase was optimized. The protein was expressed as a His-tag fusion protein and its purification is composed from two steps: the chelating chromatography and the size-exclusion chromatography. The dynamic light scattering and the 1 H nuclear magnetic resonance were used to verify its monodispersity, and hence its suitability for further experiments.
Keywords:
expression; NMR; purification; regulation; Tyrosine hydroxylase; exprese; NMR; purifikace; regulace; Tyrosinhydroxylasa
Institution: Charles University Faculties (theses)
(web)
Document availability information: Available in the Charles University Digital Repository. Original record: http://hdl.handle.net/20.500.11956/33816