Original title:
Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb rodu Acanthamoeba, potencionálních lidských patogenů
Translated title:
Molecular characterization of selected strains of amoebae of the genus Acanthamoeba, the potential human parasites.
Authors:
ŠTAUBEROVÁ, Kamila Document type: Bachelor's theses
Year:
2014
Language:
cze Abstract:
[cze][eng] Rod Acanthamoeba patří do skupiny organismů v češtině souhrnně označovaných jako měňavky. Pro člověka mohou mít tyto améby fatální následky, dostávají se do těla člověka např. přes kůži, následně jsou krevním řečištěm rozneseny po těle, kde dále parazitují a to pak především v mozku, kde způsobují málo známé onemocnění zvané granulomatózní amébová encefalitida. Toto onemocnění se nejvíce projevuje u lidí, kteří již prodělali nějaké onemocnění, jedná se například o systémový lupus erytromatodes. Granulomatozní amébová encefalitida vyvolává především zánět mozku, který poté často způsobuje nekrózu mozkové tkáně. Mezi hlavní příznaky patří bolesti hlavy, nevolnost, zvracení, afázie a ataxie. Tato práce se zabývá i dalšími amébami jako jsou: Neagleria fowleri, Balamuthia mandrillaris, Sappinia diploidea a Entamoeba histolytica. Neagleria fowleri je známá jako původce onemocnění, které nazýváme primární amébová encefalitida.Pro izolaci DNA bylo vybráno pět kmenů améb. Jako další krok jsem prováděla amplifikaci metodou PCR, která využívá střídání nižších a vyšších teplot v přístroji zvaném termocykler. Poté následovala elektroforéza, která pomocí proužků v agarozovém gelu, který jsem si vždy sama připravovala, ukázala přítomnost nebo nepřítomnost fragmentu amébové DNA. V případě úspěšnosti, tedy přítomnosti fragmentu DNA, jsem daný fragment vyřezávala skalpelem a opatrně ho přenesla do zkumavky. Následně jsem prováděla extrakci, tedy přečištění. Extrakci jsem prováděla pomocí Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit, dle návodu výrobce. Jako mezikrok před sekvenováním jsem prováděla klonování, které, jak se poté ukázalo, nebylo příliš efektivní. Co se týče samotného sekvenování, to provádí firma Seqme.Následné zpracování sekvencí jsem prováděla v programu BioEdit a alignování v ClustalX. Poté následovala tvorba fylogenetických stromů v programu PAUP a jejich vizualizace v TreeView. Na základě těchto výsledků jsem zjišťovala příbuznost améb, ukázalo se, že většina améb sice patří do hojně zastoupeného genotypu T4, ale jejich příbuznost v rámci něj nijak velká není. Co se týče klinických vzorků, které jsem měla k dispozici (oba dva z lidských očí), tak zde se vzorek O1 zařadil do genotypu T4, ale naproti tomu vzorek O2 se zařadil do genotypu T3. Dále byla vyhodnocena efektivnost používaných primerů: specifické primery AcaJDP1 a AcaJDP2 byly o hodně účinnější, než původně použité "eukaryotické" primery ERIB1 a ERIB10.The genus Acanthamoeba belongs to a group of organisms generally called "amoebae". These amoebae can cause fatal disease in humans, being able to enter e.g. through skin in bloodstream and then spreading through the body. In the body they further parasitize in various tissues including the brain there they cause a little known disease called "granulomatous amoebic encephalitis". The disease is most prevalent in people previously ill with, e.g., systemic lupus erythematosus. Granulomatous amoebic encephalitis leads especially to a brain inflammation, which evolves in brain tissue necrosis. Most prominent symptoms are headaches, nausea and vomiting, aphasia and ataxia. This work mentions also some other amoebae as Neagleria fowleri, Balamuthia mandrillaris, Sappinia diploidea a Entamoeba histolytica. Neagleria fowleri is known as a causative agent of an illness called primary amoebic encephalitis. First, I had isolated DNA using Genomic Mini Kit from five amoeba strains. The next step was PCR amplification it is a method depending on alternation of high and lower temperatures in thermocycler. It was followed by electrophoresis, where the presence of bands in agarose gel, which I had prepared myself, showed the presence of absence of amoebic DNA fragments. In case of successful amplification (presence of PCR product) the fragment was excised from gel with scalpel and transferred in a test-tube. The DNA was then cleaned via extraction. The extraction was done with Gel/DNA Fragments Extraction Kit. An intermediate step before sequencing, we tried to clone the product it became obvious that this way is not very effective. The sequencing was provided by the company Seqme. Following work with sequences was conducted in programs BioEdit and alignment in ClustalX. Then, phylogenetic trees were computed in the program PAUP and viewed in TreeView. The results were interpreted in the terms of relationships between the amoebae majority of them belonged to the most common genotype, T4, but their relations within the genotype were not so tight. Concerning the clinical samples available to me (both from human eyes), one of them (O1) belonged to T4 genotype, whereas the other one (O2) belonged to the genotype T3. Another result was evaluation of the effectivity of different primers: specific primers AcaJDP1 and AcaJDP2 were much more efficient than originally used "eukaryotic" primers ERIB1 and ERIB10.
Keywords:
Acanthamoeba; granulomatous amoebic encep; keratitis; phylogeny; Acanthamoeba; fylogeneze; granulomatózní amébová encefalitida; keratitida Citation: ŠTAUBEROVÁ, Kamila. Molekulární charakterizace vybraných kmenů améb rodu Acanthamoeba, potencionálních lidských patogenů. České Budějovice, 2014. bakalářská práce (Bc.). JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH. Zdravotně sociální fakulta
Institution: University of South Bohemia in České Budějovice
(web)
Document availability information: Fulltext is available in the Digital Repository of University of South Bohemia. Original record: http://www.jcu.cz/vskp/38731
guest ::
