| |
|
Metabolická detoxikace karcinogenních aristolochových kyselin cytochromy P450
Levová, Kateřina
Aristolochové kyseliny jsou látky rostlinného původu vyskytující se v rostlinách čeledi podražcovitých (Aristolochiaceae). Karcinogenní a nefrotoxický rostlinný alkaloid, aristolochová kyselina I (AAI), která je v těchto rostlinách zastoupena majoritně, je příčinou onemocnění označovaného jako nefropatie vyvolaná AAI (aristolochic acid nephropathy, AAN). Pro chorobu je charakteristické chronické ledvinné selhání, tubulointersticiální fibrosa a nádory močových cest. AAI participuje také na vývoji podobné fibrosy provázené nádory močových cest, balkánské endemické nefropatie (BEN). Zajímavé je, že ne všichni jedinci vystaveni působení AAI onemocní těmito chorobami. Jedním z možných vysvětlení mohou být rozdílné hladiny a aktivity enzymů metabolizujících AAI. Poznání enzymů participujících na metabolismu AAI a také vliv exprese a aktivit těchto enzymů jsou esenciální pro zhodnocení vnímavosti lidských jedinců vůči tomuto karcinogenu. Jako detoxikační cesta aristolochové kyseliny byla popsána její oxidace (demethylace) cytochromy P450 na aristolochovou kyselinu Ia (AAIa). Tvorba tohoto detoxikačního metabolitu AAI in vitro byla sledována pomocí metody HPLC. Tato práce se zaměřuje na identifikaci mikrosomálních cytochromů P450 jater potkana a člověka oxidujících aristolochovou kyselinu I. Testována byla...
|
|
Studium deficitu lidské F1Fo-ATPsyntázy
Suldovská, Sabina ; Tesařová, Markéta (vedoucí práce) ; Černá, Leona (oponent)
F1FO-ATPsyntáza je klíčovým enzymem buněčného energetického metabolismu. Její případný deficit může být způsoben mutacemi ve dvou strukturních genech MT-ATP6 a MT- ATP8 v mitochondriální DNA či v jaderných genech ATPAF2 a TMEM70 kódující faktory pro biogenezi enzymu a strukturním genu ATP5E. Deficit F1FO-ATPsyntázy vede k rozvoji velmi závažného fenotypu postihující orgány s vysokými energetickými nároky s nástupem v novorozeneckém věku a nepříznivou prognózou. Mutace v uvedených genech navíc nezpůsobují pouze kvalitativní (mutace ve strukturních podjednotkách enzymu) či kvantitativní (mutace v genech pro faktory biogeneze enzymu) defekty, ale také jejich kombinace. Při studiu molekulární podstaty mitochondriálních onemocnění včetně deficitu F1FO-ATPsyntázy se využívá široká škála biochemických i molekulárně-genetických metod pro stanovení správné diagnózy, která je nezbytná pro včasné zahájení symptomatické léčby a genetické poradenství v postižených rodinách. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat deficit F1FO-ATPsyntázy v izolovaných mitochondriích z linií kultivovaných buněk stanovením oligomycin-sensitivní ATP- hydrolytické aktivity F1FO-ATPsyntázy, enzymových aktivit komplexů dýchacího řetězce a sledováním změn v množství jednotlivých vybraných podjednotek a celého komplexu F1FO-...
|
|
Mitochondriální cytochrom c oxidasa: inhibice kyanidem a vliv defektu asemblačního faktoru Surf1
Nůsková, Hana ; Kalous, Martin (oponent) ; Drahota, Zdeněk (vedoucí práce)
Aktivita mitochondriální cytochrom c oxidasy (COX, EC 1.9.3.1) může být ovlivněna jak faktory exogenními, tak endogenními. Nejúčinnější a v prostředí se nejhojněji vyskytující látkou, jež inhibuje COX, je kyanid. Velmi častá příčina lidské deficience COX je představována defektem v genu SURF1. Mechanismus inhibičního účinku kyanidu na COX stejně jako podmínky jeho zvratu nejsou zcela vysvětleny. Tři parametry funkce COX, jmenovitě transport elektronů (spotřeba kyslíku), transport protonů (mitochondriální membránový potenciál, m) a afinita ke kyslíku (hodnota p50), byly studovány s ohledem na inhibici KCN a její zvrat pyruvátem. Analyzována byla funkce COX v intaktních izolovaných mitochondriích jak v rámci dýchacího řetězce, tak jako samostatný enzym za použití sukcinátu nebo arteficielního elektronového donoru askorbát + TMPD. 250 M KCN zcela inhiboval elektron- i protontransportní funkci COX a tato inhibice byla plně reverzibilní, což se projevilo plnou aktivitou po promytí mitochondrií. Přidání 60 mM pyruvátu vyvolalo maximální obnovu obou parametrů pouze na 60 - 80 % původních hodnot. KCN o nízkých koncentracích do 5 M způsobil výrazný, třicetinásobný pokles afinity COX ke kyslíku. Tento pokles byl opět plně reverzibilní promytím mitochondrií, zatímco podání pyruvátu vedlo jen k částečné,...
|
|
Regulace exprese biotransformačních enzymů a transportérů placentární bariéry
Stejskalová, Lucie ; Pávek, Petr (vedoucí práce) ; Modrianský, Martin (oponent) ; Vondráček, Jan (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Farmakologie a toxikologie Kandidát Mgr. Lucie Stejskalová Školitel Doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Název disertační práce Regulace exprese biotransformačních enzymů a transportérů placentární bariéry Placenta je jedinečný orgán komunikace mezi matkou a plodem. Je nezbytná pro udržení těhotenství, vývoj plodu, ochranu plodu a zajišťuje řadu funkcí, především pak výměnu látek a plynů mezi matkou a plodem. Významná je také její endokrinní a metabolická funkce. Klíčovou roli v ochraně plodu hraje vrstva syncytiotrofoblastu, která funguje nejen jako fyziologická bariéra, ale také jako metabolická bariéra díky expresi mnoha biotransformačních enzymů a transportérů. Hladina jednotlivých biotransformačních enzymů se v průběhu těhotenství mění. Většina enzymů má velmi nízké množství mRNA a v některých případech nebyla zjištěna ani jejich významná hladina proteinu či enzymová aktivita. Cytochrom CYP1A1 je jediný placentární enzym metabolizující xenobiotika, jehož exprese a aktivita je signifikantní po celou dobu těhotenství. Navíc se zjistilo, že exprese a aktivita placentárního CYP1A1 je silně indukována u matek kuřaček a v choriokarcinomových buněčných liniích BeWo a JEG-3 při jejich kultivaci s ligandy arylhydrokarbonového...
|
|
Biochemical and molecular studies of cytochrome c oxidase and ATP synthase deficiencies
Fornůsková, Daniela ; Zeman, Jiří (vedoucí práce) ; Hyánek, Josef (oponent) ; Stiborová, Marie (oponent)
Mgr. Daniela Fornůsková Disertační práce Studium poruch cytochrom c oxidasy a ATP synthasy na biochemické a molekulární úrovni ABSTRAKT Savčí organismus je plně závislý na systému oxidativní fosforylace (OXPHOS) jako hlavním zdroji produkce energie (ATP) v buňce. Poruchy OXPHOS mohou být způsobeny mutacemi v genech kódovaných mitochondriální DNA nebo jadernou DNA. Část výzkumné práce je zaměřena na roli raně a pozdně se asemblujících, jaderně kódovaných, strukturních podjednotek cytochrom c oxidasy (CcO) a Oxa1l, lidského homologu kvasinkové mitochondriální Oxa1 translokasy, v biogenezi cytochrom c oxidasy a její funkci s využitím stabilní RNA interference COX4, COX5A, COX6A1 a OXA1L a ektopické exprese epitopově značených podjednotek Cox6a, Cox7a a Cox7b v buněčné linii HEK (lidské embryonální ledviny)-293. Naše výsledky ukazují, že zatímco podjednotky Cox4 a Cox5a jsou nezbytné pro asemblaci funkčního komplexu CcO, Cox6a podjednotka je důležitá pro její stabilitu. V buňkách se sníženou expresí OXA1L byla překvapivě zjištěna normální aktivita i hladina holoenzymu CcO, přestože inaktivace OXA1 u kvasinek vyvolá kompletní ztrátu aktivity CcO. Při studiu poruch OXPHOS v izolovaných mitochondriích kosterního svalu, srdce, jater a frontálního kortexu získaných od pacientů s Leigh syndromem (mtDNA mutace...
|
|
Role reaktivních forem kyslíku a proteinové fosforylace na funkci spermií ryb
GAZO, Ievgeniia
Spermie druhů ryb s vnějším oplozením jsou po uvolnění do vodního prostředí zvláště citlivé na poškození hlavně kvůli změnám ve složení média v okolní spermatu. Mezi faktory ovlivňující pohyb spermií v externím médiu jsou: znečištěná voda, teplota, pH a osmotické podmínky. Cílem této studie bylo zjistit, účinky oxidačního stresu a možné následky související s výkonností spermií a intracelulární signalizací, zejména díky vlivu znečišťujících látek, vyskytujících se ve vodním prostředí. Navíc molekulární mechanismy stresových reakcí a aktivační proces pohyblivosti spermií byly analyzovány u více druhů sladkovodních ryb. Naše výsledky prokázaly, že xenobiotika, jako je Vinclozolin, mohou vyvolat snížení pohyblivosti a rychlosti spermií u jesetera malého (Acipenser ruthenus) již při koncentracích vyskytující se přirozeně ve vodním prostředí. Zvýšené hladiny lipidové oxidace (LO) a proteinové karbonylace (CP), stejně jako změny v antioxidačním účinku superoxid-dismutázy (SOD) poukazují na vývoj oxidačního stresu u spermií, které byly předem vystaveny xenobiotikům. Dále byla pozorována zvýšená fragmentace DNA a snížená úroveň ATP u spermií, které byly ovlivněny cizorodými látkami in vitro. Tyto výsledky naznačují, že spermie jesetera malého jsou velmi citlivé na přítomnost škodlivých látek a nadměrnou produkci ROS, které jsou vyvolány již při nízkých koncentracích. Další studie byly provedeny za účelem vyhodnotit úlohy produkce ROS u rybích spermií a potvrdit ochranné vlastnosti semenné tekutiny. ROS byl vygenerován inkubací kapřích (Cyprinus carpio L.) spermií in vitro s xanthin - xanthinoxidázou systémem (X-XO). Dávka škodlivé látky a doba působení měly vliv na snížení pohyblivosti a rychlosti spermií, stejně tak byla pozorována zvýšená hladina LO, CP a DNA fragmentace. Navíc bylo prokázáno, že O-spojeno s N-acetylglukosamin transferázou a septin-8-A změnil jejich stav fosforylace a kyselá fosfatáza v reakci na oxidační stres byla snížena. Na druhé straně, kataláza (CAT), superoxiddismutáza (SOD), glutathion a (GTH) v kombinaci se semennou plazmou má vliv na snížení oxidačního stresu u spermií kapra a zvýšení jejich kvality. Naše další studie byla použita ke stanovení, jak byly fosforylací proteiny pozměny po aktivaci pohyblivosti spermatu u kapra a jesetera, kde se fosforylované proteiny nacházejí ve spermatu a identifikované proteiny jsou zapojeny do procesu pohyblivost spermií. Ukázalo se, že typ proteinové fosforylace a její lokalizace se značně liší u obou druhů ryb. Fosforylace na serinovém a tyrosinovém zbytku, stejně jako protein-kináza A (PKA) a protein-kináza C (PKC) hrají důležitou roli u pohyblivosti, aktivace a regulaci spermií u obou druhů. Nespočet signalizačních proteinů podílejících se na pohybu spermií kapra a jesetera, byly identifikovány v této studii, a tudíž máme o krůček lepší pochopení molekulárních mechanismů u parametru pohyblivost spermií. Na závěr, výsledky této studie poskytují nové údaje o vlivu xenobiotik a oxidačního stresu na pohyblivosti rybích spermií, integritu DNA, lipidové a proteinové oxidaci, antioxidační obranný systém a intracelulární signalizaci. Naše údaje prokázaly toxicitu znečišťujících látek ve vodě a ROS u rybích spermií a navrhované využití CAT, SOD, nebo GTH v kombinaci se semennou plazmou pro snížení oxidačního stresu ve spermatu. Navíc bylo identifikováno mnoho proteinů ve spermiích, podílejících se na stresové reakci a pohyblivosti. Pro praxi, údaje uvedené v této práci, by mohly být užitečné pro zpracování médií vhodné pro kryoprezervaci a umělé rozmnožování různých druhů sladkovodních ryb.
|
|
Nepřekládané RNA v herpesvirové infekci
Pelák, Ondřej ; Holá, Dana (oponent) ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce)
MiRNA jsou endogenní krátké RNA, které jsou v eukaryotických organismech velice konzervované a tak se zdá, že jsou nezbytnou a evolučně starou součástí genové regulace. Význam miRNA je především ve specifické post-transkripční regulaci genové exprese. Některé viry dokázaly využít možností těchto malých RNA k regulaci vlastní genové exprese, nebo dokonce k regulaci hostitelské exprese a tím se vyhnout imunitní odpovědi na jejich přítomnost. Mezi tyto viry patří i čeleď Herpesviridae, jejíž jednotliví zástupci využívají miRNA k nejrůznějším účelům, od regulace jejich životních cyklů až po cílení hostitelských mRNA, čímž zabraňují translaci faktorů spojených s imunitní odpovědí na jejich přítomnost. Tato práce je zaměřena na biogenezi miRNA, její mechanismus, funkci a způsob jakým ji využívají jednotliví zástupci z čeledi Herpesviridae.
|
|
Molecular mechanisms of Diamond-Blackfan anemia
Handrková, Helena ; Petrák, Jiří (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Trka, Jan (oponent)
Diamondova-Blackfanova anémie (DBA) je vzácný vrozený syndrom, jehož hlavními příznaky jsou normochromní makrocytická anémie a retikulocytopenie (selektivní de- ficience erythroidních prekurzorů). Přibližně polovina pacientů vykazuje další somat- ické anomálie a zpomalený růst. Terapie je symptomatická, ve většině případů jsou podávány kortikosteroidy. Na počátku této práce byly známy jen dva geny kauzální pro DBA, a sice geny kódující ribosomální proteiny (RP) S19 a S24, a jejich mutace byly nalezeny u čtvrtiny pacient s DBA. Cíli mého výzkumu bylo popsat důsledky těchto kauzálních mutací na úrovni buňky a najít další kauzální geny. Doposud byla u více než poloviny pacientů nalezena mutace v jednom z devíti genů kódujících ribosomální proteiny, včetně RPS17, RPL11 a RPL5, které jsou předmětem této disertační práce. Dále jsme studovali význam jedné vzácné sekvenční varianty ner- ibosomálního proteinu, který se účastní biogeneze ribosomů, protein arginin methyl- transferasy 3 (PRMT3). Varianta PRMT3 nalezená u jednoho z našich DBA pacientů nebyla plně funkční, ale její kauzální roli pro DBA jsme nepotvrdili. Naše poznatky přispěly k rozšíření spektra známých genů kauzálních pro DBA a podpořily hypotézu, že mechanismus patogeneze tohoto onemocnění spočívá v ribosomálním defektu. Klíčová slova...
|
|
Porovnání hladiny celkového cholesterolu v séru obyvatel Plzeňska a Českobudějovicka za předpokladu podobných stravovacích návyků
FRAITOVÁ, Lucie
Stanovení cholesterolu je považováno za screeningové vyšetření využívané především ke stanovení kardiovaskulárního rizika a k monitorování hypolipidemické léčby. Jelikož se jedná o screeningové vyšetření, je zapotřebí další laboratorní vyšetření, tzv. lipidový profil (HDL cholesterol, LDL cholesterol, triacylglyceroly). Pacienti, u kterých se provádí vyšetření sloužící pro kontrolu hypolipidemické léčby, musejí dodržovat dietu. Těmto pacientům se vyšetření provádí častěji. Obyvatelé České Republiky jsou považováni za populaci ohroženou předčasným výskytem aterosklerózy a jejími komplikacemi. Každý rok umírá v České Republice na srdeční a cévní onemocnění skoro 60 000 osob. Kardiovaskulární onemocnění postihuje stále mladší věkovou skupinu. Jsou také příčinou invalidity lidí v produktivním věku. Jedním z hlavních ukazatelů je vysoká hladina cholesterolu. Správné a přesné měření hladiny cholesterolu v krvi hraje roli v redukci morbidity a mortality u lidí se srdečně cévním onemocněním. Mezi cíle mé bakalářské práce patří: 1)Změřit hladiny celkového cholesterolu vzorků obyvatel Plzeňska a Českobudějovicka 2)Porovnat a zjistit rozdíly v hladině celkového cholesterolu v obou lokalitách V teoretické části bakalářské práce jsem se zajímala o to, jaké potraviny zvyšují cholesterol a jakými potravinami můžeme vysokou hladinu cholesterolu snížit. Dále jsou v teoretické části popsána onemocnění, která se mohou při hypercholesterolémii objevit. Mezi nejzákladnější patří ateroskleróza a její komplikace, jimiž jsou ischemická choroba srdeční či cévní mozková příhoda. Jsou zde popsané preanalytické faktory, které mohou významně ovlivnit laboratorní vyšetření. V praktické části je popsáno vše od příjmu biologického materiálu v laboratoři, přes jeho přípravu (centrifugaci, vytvoření aliquotů) až po vložení sekundárních vzorku do analytického přístroje. Výzkum k bakalářské práci jsem uskutečnila v biochemické laboratoři synlab czech s.r.o. v Českých Budějovicích. Zde jsem pod odborným dohledem vyšetřila celkem 100 vzorků venózní krve z Plzně a Českých Budějovic, u nichž jsem stanovila hladinu celkového cholesterolu v séru. Vyšetření biologického materiálu jsem provedla na automatickém biochemickém analyzátoru Cobas Integra 800. Ke stanovení cholesterolu se v rutinní praxi využívají enzymatické metody. Estery cholesterolu jsou cholesterol esterázou převedeny na volný cholesterol a mastné kyseliny. Volný cholesterol je oxidován cholesterol oxidázou na cholestenon a peroxid vodíku. Vzniklý peroxid vodíku reaguje s 4-aminoantipyrinem a fenol za vzniku červeného zabarvení a vody. Intenzita zabarvení je přímo úměrná koncentraci cholesterolu a je stanovena absorpční spektrofotometrií při 512 nm.Naměřené laboratorní výsledky byly statisticky zpracovány a přehledně seřazeny do tabulky a grafů za pomoci počítačového programu. Výsledky z obou lokalit jsem si rozdělila podle pohlaví a vyhodnotila je pomocí grafů. Výsledky z Plzně a Českých Budějovic jsem postavila proti sobě a zjistila rozdíl v hladinách cholesterolu. Vše je uvedeno v tabulce i grafech. V Plzni byla naměřena hypercholesterolémie u 29 lidí. V Českých Budějovicích byla vysoká hladina cholesterolu detekována u 27 lidí. Výzkumem jsem zjistila, že u více než poloviny náhodně vybraných zdravých jedinců z obou lokalit, byla zjištěna vysoká hladina cholesterolu v séru. Důvodem hypercholesterolémie u většiny vzorků může být špatné stravování, špatný životný styl či neúplná informovanost veřejnosti o rizicích aterosklerózy či jejích komplikacích. Během praktické části bakalářské práce jsem si osvojila principy laboratorní metody a získala praktické dovednosti při práci s biologickým materiálem.
|
host ::
