|
|
Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování
Osadchuk, Olha ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.
|
|
|
Produkce a purifikace izoforem proteinu p53 v bakteriálním expresním systému
Vadovičová, Natália ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Protein p53 není jediným proteinem, který je kódován tumor-supresorovým genem TP53. Alternativním sestřihem, alternativním použitím promotoru a alternativními počátky translace může dojít k expresi až jedenáct dalších izoforem. Tyto izoformy byly ve zvýšeném množství pozorovány v nádorových tkáních. Jelikož jsou izoformy proteinu p53 sekvenčně, a tedy i strukturně odlišné oproti proteinu p53, mění se tím i jejich vazebné vlastnosti a funkce v buňce. Izoformy modulují funkci samotného proteinu p53, některé podporují jeho tumor-supresorovou funkci, jiné ji naopak potlačují. Objasnění mechanismu působení izoforem na děje v buňce by mohlo být využito k cílenému alternativnímu sestřihu vhodných izoforem a v léčbě rakoviny pomocí terapie založené na proteinu p53. Teoretická část diplomové práce shrnuje základní poznatky o proteinu p53 a o jeho izoformách, doplněné o výsledky výzkumů z posledních let týkajících se těchto izoforem. Dále je probrána použitá metoda, Gateway klonování. Cílem experimentální části práce byla produkce izoforem v bakteriálním expresním systému. Produkci předcházela příprava DNA sekvencí těchto dvanácti izoforem pomocí PCR a Gateway klonování. Klonováním bylo připraveno celkem dvanáct entry klonů obsahujících sekvence všech izoforem a také osm expresních klonů. Zároveň byly izolací získány a pomocí SDS-PAGE a Westernového přenosu ověřeny čtyři izoformy proteinu p53, a to p53, 40p53, 40p53 a 40p53. U izoforem budou v rámci navazujícího výzkumu testovány jejich DNA vazebné vlastnosti.
|
|
|
Strukturní analýza interakčního rozhraní mezi protilátkou a proteinovým epitopem
Moravec, Jan ; Krejčíř, Radovan (oponent) ; Müller,, Petr (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá studiem myší monoklonální protilátky EEV1-2.1, která byla vytvořena v laboratořích RECAMO imunizací myši proteinem Hsp90 a následnou fúzí splenocytů s myší myelomovou linii. Teoretická část této práce se zaměřuje především na studium protilátek, zejména jejich struktury, genetiky a popis monoklonálních protilátek. V této části práce lze dále najít průřez moderními biotechnologickými trendy, které jsou v současné době používány k produkci protilátek. Dále jsou popsány CHO buňky a tetracyklinové inducibilní systémy. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat zmíněnou protilátku. Pomocí bioinformatických metod a predikčních softwarů predikovat a popsat její strukturu, především potom analyzovat hypervariabilní CDR oblasti. Dalším cílem bylo pomocí metody Gateway klonovat lehký a těžký řetězec protilátky. Finálním krokem bylo vytvoření tetracyklinového inducibilního systému pro efektivní produkci samotné protilátky. Experimentální část práce se úvodem zabývá izolací RNA sekvence protilátky pomocí komerčních kitů. Dále je popsána metoda amplifikace dané sekvence pomocí PCR s reverzní transkripcí. Následuje popis metody Gateway klonování, která umožňuje pohodlné vložení vybraného genu do cílového vektoru. Objasněny jsou též základní bioinformatické metody použité ke studiu struktury protilátek a také predikce komplexnější 3D struktury protilátky včetně možných interakcí s proteinem HSP90. V této části lze najít popis metod transfekce ExpiCHO buněk a inducibilní produkce protilátky využívající tetracyklinový inducibilní systém. Diplomová práce vedla k úspěšnému naklonování lehkého a těžkého řetězce protilátky a následnému vložení expresního vektoru do produkčních ExpiCHO buněk. Expresní systém na bázi indukce přídavkem doxycyklinu byl poté úspěšně testován několika metodami a výsledky ukazují, že je inducibilní systém nejen funkční, ale může dokonce vést ke zvýšené produkci monoklonální protilátky oproti konvenčním metodám.
|
|
|
Diversity of Polycomb complexes and their function
ŘÍHA, Luboš
Cílem této práce je testování a další vývoj systému vektorů (plazmidů). Tento systém by měl přispět k vyjasnění domnělé překrývající se funkce podjednotek Polycomb represivního komplexu 2 (PRC2). V teoretické části je uvedena epigenetika jako vědní obor a je vysvětlena důležitost Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní)ve výzkumu. Problematika překrývající se funkce podjednotek PRC2 SWINGER a CURLY LEAF je postavena do kontextu a je zformulována hlavní otázka projektu. Důležité prvky genetického inženýrstvíjsou vysvětleny. A nakonec je objasněna praktická část projektu, kde se vyvíjel systém vektorů s promotory a markery a proběhla selekce a genotypování transgenních rostlin. Výsledky byly prezentovány a diskutovány.
|
|
| |
|
|
Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování
Osadchuk, Olha ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.
|
|
|
Produkce a purifikace izoforem proteinu p53 v bakteriálním expresním systému
Vadovičová, Natália ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Protein p53 není jediným proteinem, který je kódován tumor-supresorovým genem TP53. Alternativním sestřihem, alternativním použitím promotoru a alternativními počátky translace může dojít k expresi až jedenáct dalších izoforem. Tyto izoformy byly ve zvýšeném množství pozorovány v nádorových tkáních. Jelikož jsou izoformy proteinu p53 sekvenčně, a tedy i strukturně odlišné oproti proteinu p53, mění se tím i jejich vazebné vlastnosti a funkce v buňce. Izoformy modulují funkci samotného proteinu p53, některé podporují jeho tumor-supresorovou funkci, jiné ji naopak potlačují. Objasnění mechanismu působení izoforem na děje v buňce by mohlo být využito k cílenému alternativnímu sestřihu vhodných izoforem a v léčbě rakoviny pomocí terapie založené na proteinu p53. Teoretická část diplomové práce shrnuje základní poznatky o proteinu p53 a o jeho izoformách, doplněné o výsledky výzkumů z posledních let týkajících se těchto izoforem. Dále je probrána použitá metoda, Gateway klonování. Cílem experimentální části práce byla produkce izoforem v bakteriálním expresním systému. Produkci předcházela příprava DNA sekvencí těchto dvanácti izoforem pomocí PCR a Gateway klonování. Klonováním bylo připraveno celkem dvanáct entry klonů obsahujících sekvence všech izoforem a také osm expresních klonů. Zároveň byly izolací získány a pomocí SDS-PAGE a Westernového přenosu ověřeny čtyři izoformy proteinu p53, a to p53, 40p53, 40p53 a 40p53. U izoforem budou v rámci navazujícího výzkumu testovány jejich DNA vazebné vlastnosti.
|
host ::
RSS.