|
|
Strukturní analýza interakčního rozhraní mezi protilátkou a proteinovým epitopem
Moravec, Jan ; Krejčíř, Radovan (oponent) ; Müller,, Petr (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá studiem myší monoklonální protilátky EEV1-2.1, která byla vytvořena v laboratořích RECAMO imunizací myši proteinem Hsp90 a následnou fúzí splenocytů s myší myelomovou linii. Teoretická část této práce se zaměřuje především na studium protilátek, zejména jejich struktury, genetiky a popis monoklonálních protilátek. V této části práce lze dále najít průřez moderními biotechnologickými trendy, které jsou v současné době používány k produkci protilátek. Dále jsou popsány CHO buňky a tetracyklinové inducibilní systémy. Cílem diplomové práce bylo charakterizovat zmíněnou protilátku. Pomocí bioinformatických metod a predikčních softwarů predikovat a popsat její strukturu, především potom analyzovat hypervariabilní CDR oblasti. Dalším cílem bylo pomocí metody Gateway klonovat lehký a těžký řetězec protilátky. Finálním krokem bylo vytvoření tetracyklinového inducibilního systému pro efektivní produkci samotné protilátky. Experimentální část práce se úvodem zabývá izolací RNA sekvence protilátky pomocí komerčních kitů. Dále je popsána metoda amplifikace dané sekvence pomocí PCR s reverzní transkripcí. Následuje popis metody Gateway klonování, která umožňuje pohodlné vložení vybraného genu do cílového vektoru. Objasněny jsou též základní bioinformatické metody použité ke studiu struktury protilátek a také predikce komplexnější 3D struktury protilátky včetně možných interakcí s proteinem HSP90. V této části lze najít popis metod transfekce ExpiCHO buněk a inducibilní produkce protilátky využívající tetracyklinový inducibilní systém. Diplomová práce vedla k úspěšnému naklonování lehkého a těžkého řetězce protilátky a následnému vložení expresního vektoru do produkčních ExpiCHO buněk. Expresní systém na bázi indukce přídavkem doxycyklinu byl poté úspěšně testován několika metodami a výsledky ukazují, že je inducibilní systém nejen funkční, ale může dokonce vést ke zvýšené produkci monoklonální protilátky oproti konvenčním metodám.
|
host ::
RSS.