|
|
Interakce proteinových podjednotek SEC10 a SEC15 poutacího komplexu exocyst
Bartáková, Anna ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Exocyst je evolučně konzervovaný poutací komplex zapojený do regulace sekreční dráhy v eukaryotických buňkách. Jakožto efektor malých GTPáz zásadně přispívá ke správnému cílení sekrečních váčků do místa intenzivní exocytózy na plazmatické membráně díky interakci se specifickými fosfolipidy. Komplex exocyst se skládá z osmi podjednotek: SEC3, SEC5, SEC6, SEC8, SEC10, SEC15, EXO70 a EXO84, přičemž každá podjednotka se váže s minimálně dvěma dalšími podjednotkami. Pro funkci exocystu je klíčová interakce SEC10 a SEC15. Otázkou zůstává, jak jsou tyto dvě podjednotky v rámci rostlin funkčně konzervované. Geny SEC10 a SEC15 ze zástupců tří evolučně rozdílných skupin rostlin (zelené řasy - Klebsormidium nitens, mechu - Marchantia polymorpha, krytosemenné - Arabidopsis thaliana) byly klonovány do vektorů kvasinkového dvouhybridního systému pro studium proteinových interakcí. Testování vzájemné interakce SEC10 a SEC15 z odlišných druhů rostlin v kvasinkovém dvouhybridním systému ukázalo, že i přes variabilitu v proteinových sekvencích těchto podjednotek, zůstává jejich interakce napříč evolučními skupinami rostlin velmi dobře zachována.
|
|
|
The Role of selected exocyst subunits in response of plants to pathogen
Sabol, Peter ; Kulich, Ivan (vedoucí práce) ; Burketová, Lenka (oponent) ; Dagdas, Yasin (oponent)
V posledních létech se objevuje narůstající počet publikací naznačujících zapojení rostlinné sekretorické dráhy do obrany vůči fytopatogenům. Konkrétně, v rámci současného výzkumu byly detailněji objevovány úlohy rostlinného komplexu exocyst. Přesto, jak přesně exocystem zprostředkovaná exocytóza přispívá k sekreci antimikrobiálních látek a obraně založené na buněčné stěně zůstává neobjasněno. V předkládané práci poskytuji experimentální důkazy a navrhuji další hypotézy o vybraných podjednotkách exocystu v imunitní reakci rostlin. Zvláště ukazuji, že EXO70B1 podjednotka exocystu interaguje s proteinem souvisejícím s imunitou, RIN4. Štěpení RIN4 pomocí AvrRpt2 Pseudomonas syringae efektorové proteázy uvolňuje jak RIN4 fragmenty, tak EXO70B1 z plazmatické membrány, když je tranzientně exprimován v listech Nicotiana benthamiana. Spekuluji o tom, jak by to mohlo mít vliv na regulaci polarizované depozice kalózy. Ve společně vypracovaném článku jsme také navrhli hypotézu, že EXO70B1- zprostředkovaná autofagická degradace TN2 rezistenčního proteinu zabraňuje jeho hyperaktivaci a vývoji fenotypů mimikujících léze. Kromě toho ve spolupráci s kolegy uvádím údaje o účasti EXO70H4 v sekreci kalózasyntázy PMR4, potřebnou pro depozici křemíku. Představujíc možný konvergentní mechanismus navrhujeme, že EXO70H4...
|
|
|
Functional specialization of EXO70A and EXO70B paralogs of the EXO70 exocyst subunit in Arabidopsis.
Markovič, Vedrana ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Yalovsky, Shaul (oponent) ; Ovečka, Miroslav (oponent)
SOUHRN Studium komplexu exocyst poutajícího sekreční váčky u eukaryot ukazuje jeho zásadní význam pro buněčné procesy závislé na intenzivní a polarizované buněčné sekreci. U rostlin exocyst reguluje buněčnou polaritu, podmiňuje morfogenetické procesy a přispívá i k obranným reakcím. Gen kódující podjednotku exocystu EXO70 v rostlinách proliferoval do celé genové rodiny, přičemž pouze u některých isoforem EXO70 byly zatím popsány jejich funkce. Tato dizertační práce odhalila, že isoforma EXO70A2 z podrodiny EXO70.1 je hlavní isoformou EXO70 sloužící jako podjednotka komplexu exocyst při exocytóze v pylu. EXO70A2 je zásadní pro několik fází vývoje pylu u huseníčku - zrání pylových zrn, jejich klíčení a růst pylové láčky. Zatímco pylově specifická isoforma EXO70A2 má schopnost nahradit isoformu EXO70A1 fungující ve sporofytu, funkční substituce k opačném směru možná není, což dokazuje omezenou redundanci těchto dvou blízce příbuzných isoforem a vysokou specificitu funkcí EXO70 v pylu. V práci je dále popsáno zjištění, že exocyst je rekrutován k plazmatické membráně prostřednictvím EXO70A1. Tato podjednotka interaguje prostřednictvím konzervovaných lyzinových zbytků se specifickými fosfolipidy, které tvoří unikátní znak rostlinné membrány. Další isoforma, EXO70B1 z podrodiny EXO70.2, se účastní regulace...
|
|
|
Akrozomální reakce savčí spermie
Picková, Jana ; Frolíková, Michaela (vedoucí práce) ; Kuntová, Barbora (oponent)
K akrozomální reakci (AR) spermie dochází in vivo v reprodukčním traktu samice a tento děj je nezbytnou prerekvizitou k tomu, aby spermie mohla oplodnit vajíčko. AR umožňuje spermii proniknout obaly vajíčka a splynout s ním. Spermie musí nejdříve projít procesem kapacitace a teprve poté může dojít k iniciaci AR a vylití akrozomálního obsahu. Co je induktorem AR není stále zcela jasné, důležitou roli hrají nejspíše extracelulární obaly vajíčka - zona pellucida a kumulární buňky vylučující progesteron a jiné látky, u nichž byla prokázána schopnost AR iniciovat. V poslední době je předmětem intenzivního studia identifikace místa iniciace AR v rámci reprodukčního traktu samice. Ukázalo se, že u myší podstoupí většina spermií AR v horním isthmu. V ampule se pak nachází jen malé množství spermií a všechny tyto spermie jsou schopné vajíčko oplodnit. Během AR dochází k uvolňování akrozomálního obsahu do extracelulárního prostředí. Nejdříve dochází k uvolnění rozpustné složky akrozomu a až poté je postupně uvolněna akrozomální matrix. Před vylitím obsahu akrozomu musí dojít přes receptory spřažené s G proteiny a receptory tyrosinkinázy k aktivaci fosfolipáz. Poté, co jsou aktivovány i proteinkinázy, dochází k aktivaci kanálů na akrozomu i na plazmatické membráně spermie a uvolnění Ca2+ . Dále jsou...
|
|
|
Studium funkce genů EXO70H7 a EXO70H8 ve vývoji Arabidopsis thaliana.
Modráčková, Jana ; Kubátová, Zdeňka (vedoucí práce) ; Soukup, Aleš (oponent)
Komplex exocyst je osmi-proteinový komplex známý též jako Sec6/8 a jeho kompozice je evolučně vysoce konzervovaná napříč organismy. Tento komplex se účastní váčkového transportu jakožto součást poutacího mechanismu na specifické místo plazmatické membrány. V genomu Arabidopsis thaliana se jeho podjednotka EXO70 vyskytuje ve 23 kopiích tohoto genu. V práci byly studované paralogy EXO70H7 a EXO70H8, u kterých podle dosud dostupných informacích vzniklo podezření na důležitost ve vývoji kořene. U rostlin mutantních v těchto genech se během práce nepodařilo identifikovat žádný výrazný fenotypový projev. Pomocí experimentů za stresových podmínek byly testovány další projevy mutací v těchto genech. Většina těchto experimentů neidentifikovala žádné odchylky. Pouze při klíčení semen za stresových podmínek bylo zjištěno, že dochází k signifikantně horšímu klíčení mutantních semen exo70H7 na médiích obsahujících sorbitol, což poukazuje na horší obranu proti osmotickému stresu. Signifikantní zhoršení v klíčení semen exo70H8 na médiu s nadbytkem NaCl naznačuje větší náchylnost k nadbytečnému příjmu iontů sodíku. Analýza buněčné lokalizace pomocí vytvořených konstruktů s GFP přinesla poznání lokalizace těchto proteinů. EXO70H7 se lokalizuje v cytoplazmě a v jádře s negativně kontrastním jadérkem a lokalizace...
|
|
|
Rostlinné tomosyny a jejich funkce v sekreci
Dejová, Lilly ; Hála, Michal (vedoucí práce) ; Fendrych, Matyáš (oponent)
Tomosyn je protein patřící do rodiny Lgl, zároveň je konzervovaný napříč živočišnou i rostlinnou říší. Skládá se z N cího se na povrchu váčků a účastnícího se tvorby SNARE komplexu a následného fúzování váčků s plazmatickou membránou. Rolí tomosynu je tak zejména regulace exocytózy. Kromě živočišného tomosynu je prostudován jeho kvasinkový průběhu evoluce svůj R tomosyny tak zůstávají neprobádanou oblastí. Cílem této práce bylo charakterizovat oba u, tvorbu DNA konstruktů, hledání interaktorů pomocí Výsledky bioinformatické analýzy, jehož součástí bylo vytvoření fylogenetického stromu, příč různými třídami rostlin a rozdělení obou tomosynů do odlišných klastrů. V klastru s homologem AtTYN2 se nenacházel ani jeden zástupce výtrusných rostlin. Z obou tomosynů byl konfokálním mikroskopem sledován a lokalizován l v cytoplasmě. Dvouhybridní kvasinkový systém neodhalil interaktory ani v jednom z rostlinných tomosynů.
|
|
|
The Role of selected exocyst subunits in response of plants to pathogen
Sabol, Peter ; Kulich, Ivan (vedoucí práce) ; Burketová, Lenka (oponent) ; Dagdas, Yasin (oponent)
V posledních létech se objevuje narůstající počet publikací naznačujících zapojení rostlinné sekretorické dráhy do obrany vůči fytopatogenům. Konkrétně, v rámci současného výzkumu byly detailněji objevovány úlohy rostlinného komplexu exocyst. Přesto, jak přesně exocystem zprostředkovaná exocytóza přispívá k sekreci antimikrobiálních látek a obraně založené na buněčné stěně zůstává neobjasněno. V předkládané práci poskytuji experimentální důkazy a navrhuji další hypotézy o vybraných podjednotkách exocystu v imunitní reakci rostlin. Zvláště ukazuji, že EXO70B1 podjednotka exocystu interaguje s proteinem souvisejícím s imunitou, RIN4. Štěpení RIN4 pomocí AvrRpt2 Pseudomonas syringae efektorové proteázy uvolňuje jak RIN4 fragmenty, tak EXO70B1 z plazmatické membrány, když je tranzientně exprimován v listech Nicotiana benthamiana. Spekuluji o tom, jak by to mohlo mít vliv na regulaci polarizované depozice kalózy. Ve společně vypracovaném článku jsme také navrhli hypotézu, že EXO70B1- zprostředkovaná autofagická degradace TN2 rezistenčního proteinu zabraňuje jeho hyperaktivaci a vývoji fenotypů mimikujících léze. Kromě toho ve spolupráci s kolegy uvádím údaje o účasti EXO70H4 v sekreci kalózasyntázy PMR4, potřebnou pro depozici křemíku. Představujíc možný konvergentní mechanismus navrhujeme, že EXO70H4...
|
|
|
Role of exocyst complex in growth and development of moss Physcomitrella patens
Rawat, Anamika Ashok ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent) ; Fendrych, Matyáš (oponent)
První suchozemské rostliny získaly v průběhu svého vývoje rozsáhlá evoluční vylepšení platná i u dnešních moderních rostlin. Polární růst je pradávnou vlastností eukaryotických buněk a jednou z preadaptací, které pomohly rostlinám při úspěšné kolonizaci souše. Polární růst u rostlin určuje nejen směr expanze buněk, strukturní vlastnosti buněčné stěny, ale také orientaci buněčného dělení. Řízení polárního růstu se účastní různé faktory, včetně komplexu exocyst. Exocyst je evolučně konzervovaný poutací komplex, který se skládá z osmi podjednotek, a účastní se poutání (angl. tethering) sekretorických váčků k cílové membráně. Zásadní role komplexu exocyst v různých buněčných procesech u krytosemenných rostlin je v současnosti dobře dokumentována. V této práci prezentuji výsledky doktorandského projektu, který přispěl k fylogenetické analýze komplexu exocyst u suchozemských rostlin, a zejména k objasnění funkcí tří podjednotek exocystu, konkrétně EXO70 (isoforma PpEXO70.3d), SEC6 a SEC3 (isoformy PpSEC3A a PpSEC3B), u modelového mechu Physcomitrella patens. Několik knock-out (KO) mutantů tohoto mechu v různých podjednotkách exocystu (Ppexo70.3d, Ppsec6, Ppsec3a and Ppsec3b) vykazuje pleiotropní defekty, které jsou přímo či nepřímo propojeny s regulací buněčné polarity. Narušen je dlouživý růst a...
|
|
|
Charakterizace vybraného proteinu aktivujícího RAB GTPázy (RAB GAP) z Arabidopsis thaliana
Metlička, Jáchym ; Hála, Michal (vedoucí práce) ; Eliáš, Marek (oponent)
9 ABSTRAKT Rab GTPázy (Raby) jsou nejpočetnější rodinou eukaryotické super-rodiny Ras GTPáz. V aktivní GTP-vázající formě slouží jako nástroje vymezující proměnlivou identitu membrán a skrz rozličné efektory regulují utváření, transport, proměnu a fúzi membránových váčků. To je zásadní pro udržení kompartmentalizované struktury charakteristické pro eukaryotické buňky a pro zajištění endo- a exocytózy. K deaktivaci Rabů dochází skrz vazbu Rab GAPů, tj. proteinů disponujících schopností výrazně urychlit hydrolýzu GTP vázaného v Rabech. Tímto procesem mohou Rab GAPy omezovat rozsah aktivity Rabů a vytyčovat časoprostorové ohraničení odlišných populací Rab GTPáz. V této práci jsem se pokusil popsat Rab GAP, označený jako GAP2, který je zřejmě nutný pro standardní vývoj rostlin huseníčku rolního. Kromě charakteristické katalytické TBC domény obsahuje GAP2 (produkt genu At2g39280) C-terminální coiled-coil strukturní motiv, který byl už dříve pozorován v interakcích s konkrétními Rab GTPázami. Provedl jsem experimenty, jejichž cílem mělo být komplementování T-DNA inzerčního mutanta v genu GAP2, zjištění vnitrobuněčné lokalizace GAP2 proteinu, nalezení dosud nepopsaných interaktorů a popis interakce s Raby objevenými v pilotních experimentech. Výsledky nasvědčují, že GAP2 je primárně cytoplasmatický protein a jeho...
|
|
|
Úloha vybraných podjednotek komplexu exocyst ve vývoji epidermis Arabidopsis.
Vojtíková, Zdeňka ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Soukup, Aleš (oponent)
Exocyst je bílkovinný komplex, evolučně konzervovaný u kvasinek, živočichů i rostlin, který hraje roli v řízení buněčné morfogeneze a polarity. Jedná se o poutací komplex, jehož funkcí je navázat sekretorický váček na správné místo na plazmatické membráně. Komplex exocyst je tvořen osmi podjednotkami. Podjednotka EXO70 je v genomu Arabidopsis thaliana kódována 23 paralogními geny. Mutace v paralogní podjednotce EXO70H4 způsobuje defekt ve fázi zrání trichomů. Mutantní trichomy mají slabou, nezesílenou buněčnou stěnu, díky čemuž jsou trichomy měkké a ohebné. Transkripce genu EXO70H4 je indukována UV zářením a proto byla provedena také pozorování rostlin pěstovaných na UV-B záření. Analýza mutantů pěstovaných na UV-B záření odhalila v cytoplazmě hyperakumulaci váčků pozorovatelných světelným mikroskopem. U kontrolních rostlin pěstovaných na UV-B záření k hyperakumulaci váčků nedocházelo, ale bylo indukováno tloustnutí buněčné stěny, které dosud nebylo jako reakce na UV u trichomů nikde popsáno. Analýza buněčné lokalizace pomocí YFP značených konstruktů ukázala, že EXO70H4 lokalizuje do mobilních tělísek asociujících s Golgiho aparátem. Pomocí dvouhybridního kvasinkového systému bylo zjištěno, že EXO70H4 interaguje s TRS120, podjednotkou jiného poutacího komplexu TRAPPII aktivního na Golgiho aparátu....
|
host ::
RSS.