|
|
tRNA synthetases as potential RNA capping enzymes
Říha, Jan ; Macíčková Cahová, Hana (vedoucí práce) ; Brázdovič, Filip (oponent)
(CZ) V naší laboratoři byl nedávno objeven nový typ nekanonických RNA čepiček, obsahujících dinukleosid polyfosfáty. Abychom mohli objasnit jejich fyziologickou roli, je potřeba získat více informací o jejich syntéze v buňkách. Na základě nedávno publikovaných výsledků, dinukleosid polyfosfátové RNA (NpnN-RNA) mohou vznikat při transkripci přímou inkorporací dinukleosid polyfosfátů pomocí RNA polymerázy na počátek nově vznikajícího transkriptu (takzvaný nekanonický iniciační nukleotid). Nelze vyloučit i jiné možnosti syntézy NpnN čepičkované RNA, především jejich enzymatickou post-transkripční syntézu. Jedny z nejpravděpodobnějších kandidátů pro enzym vytvářející NpnN-RNA jsou aminoacyl-tRNA syntetázy. Tyto enzymy jsou, kromě své esenciální role v translaci, odpovědny za syntézu volných dinukleosid polyfosfátů v buňce. V této práci jsme vybrali čtyři tRNA syntetázy, klonovali je do plazmidů a purifikovali pomocí proteinové kapalinové chromatografie (fast protein liquid chromatography - FPLC). Následně byly tRNA syntetázy testovány pro syntézu volných dinukleosid polyfosfátů, díky čemuž jsme zjistili optimální reakční podmínky. Za daných reakčních podmínek jsme následně testovali, zda jsou tRNA syntetázy schopny vytvořit NpnN-RNA, a to pomocí reakce tRNA syntetáz s radioaktivně značenou RNA. Získané...
|
|
|
Methylace virových RNA
Šimonová, Anna ; Macíčková Cahová, Hana (vedoucí práce) ; Sýkora, David (oponent) ; Elleder, Daniel (oponent)
Viry svým působením zasáhly vývoj všech organizmů. Mají jednoduchou vnitřní organizaci a obsahují menší množství, většinou dobře popsaných RNA. V případě (+)ssRNA virů slouží genomová RNA rovněž jako mRNA. Díky tomu se viry jeví jako ideální modelový systém pro získání informací o nových RNA modifikacích a zároveň k pochopení funkce modifikací již popsaných. V této práci byl jako modelový systém použit zástupce retrovirů, virus lidské imunitní nedostatečnosti typ 1 (HIV-1). V další studii byli testováni čtyři zástupci pikornavirů pro popis methylačního spektra. Pro získání informace o RNA methylacích byla použita kombinace dvou technik, kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí (LC-MS) a sekvenačních technik. Výsledky LC-MS analýzy odhalily velké množství 1-methyladenosinu (m1 A) v RNA izolované z HIV-1. Mapovací technika vytvořená pro m1 A pak potvrdila přítomnost methylace pouze v přibalených tRNA. Tento výsledek následně vedl k přepočítaní RNA složení virové partikule HIV-1. V případě pikornavirů odhalila LC-MS m1 A pouze u dvou hmyzích virů (virus pytlíčkovitého plodu, SBV a virus deformovaných křídel, DWV). Stejně tak byla potvrzena i přítomnost 5-methylcytidinu (m5 C). Následné sekvenační techniky (m1 A mapování a bisulfitové sekvenování) potvrdily přítomnost m1 A a m5 C pouze v tRNA....
|
|
|
m6A RNA methylation in eukaryotic cells
Petržílková, Hana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Folk, Petr (oponent)
N6-metylace adenosinu (m6 A) je nejčastější modifikací mRNA u eukaryot. Na RNA je vytvářena metyltransferázami během transkripce, navíc může být odstraněna konkrétními demetylázami. Přítomnost těchto demetyláz umožňuje vratnost modifikace a její potenciální dynamičnost, proto by se N6-metyladenosin mohl účastnit regulace genové exprese. Od objevu první m6 A-specifické demetylázy FTO, m6 A modifikace začala být oblíbeným tématem ve výzkumu biologie RNA. N6- metyladenosin je přítomen v mRNA ale také v různých nekódujících RNA. Analýza distribuce m6 A na mRNA odhalila obohacení kolem 3' nepřekládané oblasti a pravděpodobně kolem sestřihových míst. Zatím byly objeveny dvě m6 A metyltransferázy, METTL3/METTL14 metyltransferáza je hlavním metyltransferázovým komplexem a metyltransferáza METTL16 metyluje jen malou skupinu RNA. Také jsou známy dvě demetylázy - FTO a ALKBH5. Navíc byly identifikovány proteiny vázající m6 A, které spolu sdílí strukturní doménu YTH. m6 A slouží jako buněčný signál ovlivňující různé kroky metabolismu RNA, například sestřih RNA, jaderný export, translaci nebo odbourávání RNA. Některé tyto vlivy jsou zprostředkovány m6 A-vázajícími proteiny, ale mohou se účastnit i jiné mechanismy. Přítomnost m6 A modifikace na RNA může také ovlivňovat sekundární strukturu dané RNA a tím i...
|
|
|
The function of 2'-O-methylated RNA in the context of viral infection
Potužník, Jiří ; Macíčková Cahová, Hana (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
RNA podléhá velkému množství post-transkripčních modifikací. 2'-O-metylace je přirozenou a nezbytnou modifikací RNA. Ovlivňuje její strukturu, reaktivitu a funkci. 2'-O- metylace je vysoce konzervovanou modifikací a je přítomná ve všech třech doménách života. Virová RNA využívá této modifikace k tomu, aby napodobila hostitelskou RNA a vyhnula se tak detekci hostitelským imunitním systémem. Existují dva hlavní mechanismy, pomocí kterých to 2'-O-metylovaná virová RNA dělá. Prvním způsobem je vyhnutí se rozpoznání pomocí pattern recognition receptoru Mda5. Mda5 dokáže rozpoznat nemetylovanou RNA jakožto nevlastní a následně spustit imunitní reakci. Druhým mechanismem je vyhýbání se a omezování efektorových molekul IFIT. Proteiny IFIT také dokáží detekovat nepřítomnost 2'- O-metylace na virové RNA a následně zabránit translaci virové RNA navázáním se na ternární komplex, který je nezbytný pro formaci ribozomu. Bylo dokázáno, že ovlivnění virové 2'-O- metylace může být využito pro tvorbu atenuovaných vakcín pro některá virová onemocnění. Klíčová slova: virová RNA, RNA modifikace, 2'-O-metylace, Mda5, IFIT, RIG-I-like receptors, epitranskriptomika, WNV, JEV
|
host ::
RSS.