|
|
Development and characterization of light-producing deoxyribozymes
Švehlová, Kateřina ; Curtis, Edward Arthur (vedoucí práce) ; Höbartner, Claudia (oponent) ; Renčiuk, Daniel (oponent)
Chemiluminiscenční proteinové enzymy jako je například luciferáza mají mnoho využití jak v aplikovaném tak i základním výzkumu. V této práci jsme využili metody in vitro selekce, abychom identifikovali deoxyribozymy, které katalyzují chemiluminiscenční reakci. Tyto DNA enzymy světlo produkují pomocí defosforylace komerčně dostupného substrátu CDP-Star. Jednu z nejaktivnějších variant, kterou jsme pojmenovali Supernova, jsme dále vylepšili a popsali pomocí kombinace náhodné mutageneze, in vitro reselekce, sekvenování nové generace, komparativní sekvenové analýzy a optimalizace reakčních podmínek. V současnosti Supernova produkuje světlo 6.500-krát účinněji než reakce CDP-Star bez přidaného enzymu a zaujímá nezvyklou strukturu obsahující trojšroubovici DNA. V rámci charakterizace reakčních podmínek Supernovy jsme dále popsali její nároky na pH, koncentraci Supernovy i substrátu a přítomnost iontů či zahušťovacích činidel. V neposlední řadě jsme ukázali, že Supernova může být pomocí racionálního designu přeměněna na alosterický senzor. Předpokládáme, že námi vyvinutý deoxyribozym bude využíván jako signální část v alostericky regulovaných senzorech, které detekují rozmanité ligandy, a doplní tak ostatní metody využívající radioaktivitu, fluorescenci, či změnu barvy.
|
|
|
In vitro selekce aptamerů pro methioninsulfoxid
Jureček, Matěj ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Oxidace methioninu na methioninsulfoxid je jednou z důležitých redoxních posttranslačních modifikací proteinů. Tato modifikace může aktivovat i inhibovat funkci celé řady proteinů a je součástí regulačních mechanizmů různých (pato)fyziologických procesů. Pro výzkum dopadů a funkcí oxidace methioninu by bylo užitečné nalezení bioindikátoru pro methioninsulfoxid. Zatím však nebyla pro methioninsulfoxid v rámci proteinů nalezena žádná protilátka, ani žádný její ekvivalent. Tato práce se zabývala hledáním aptameru na bázi ssDNA, specifického svou vazbou na methioninsulfoxid pomocí metody in vitro selekce (SELEX). V rámci diplomové práce byla otestována řada různých podmínek pro in vitro selekci vůči methioninsulfoxidu. Žádné podmínky nevedly k obohacení počáteční knihovny a selektivní aptamer pro methioninsulfoxid se najít nepodařilo. Nelze vyloučit, že aptamer vůči methioninsulfoxidu lze nalézt, nicméně konvenční podmínky in vitro selekce jsou zřejmě nedostatečné pro tento úkol. V rámci kontrolního in vitro selekce byla získána výrazně obohacená ssDNA knihovna vůči sulforodaminu B jako ligandu. Sekvenace klonů z této obohacené knihovny ukázala přítomnost G-bohatých sekvencí, které jsou typické pro aptamery vůči sulforodaminu B, které byly již publikovány.
|
|
|
Vývoj nové metody pro in vitro selekci DNA aptamerů
Bláhová, Kamila ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
DNA či RNA, které vázat různé molekuly (léčiva, lipidy, cukry, proteiny atd.) oligonukleotidů pomocí metody SELEX Přes úspěšnost této metody, kce často vyžaduje více než deset kol afinitní selekce a taktéž optimalizaci podmínek selekce. Pro zvýšení účinnosti selekce aptamerů bylo vyvinuto několik metod, které využívají zvýšení počtu sekundárních struktur náhodných knihovnách oligonukleotidů. Tyto metody, založené na zvýšení možnosti jednovláknových oligonukleotidech, zvýšily efektivitu metody o testováno, jestli zvýšení pravděpodobnosti výskytu kvadruplexů, jako strukturních motivů náhodných sekvencích, povede ke zvýšení efektivity selekce aptamerů. Byly použity čtyři knihovny počtem guaninu (25 %, 35 %, 45 %, 55 %) v selekci byl zvolen streptavidin, vůči kterému již bylo dříve vyselektováno několik aptamerů, (G). Předběžné výsledky naznačují, že G nezvyšují efektivitu selekce přinejmenším u molekul, které nepreferují G Klíčová slova:
|
host ::
RSS.