|
|
Nové postupy pro autonomní analýzy suchých krevních skvrn pomocí kapilární elektroforézy
Profousová, Sylvie ; Glatz, Zdeněk (oponent) ; Dvořák, Miloš (vedoucí práce)
Již nějakou dobu jsou v klinické analýze populární odběry kapilární krve, které se získávají v podobě suchých krevních skvrn (DBS) na DBS odběrové karty. Při diagnostice a monitorování metabolických poruch a onemocnění jsou ale cílové analyty (např. anorganické a organické ionty) vyšetřovány z krevní plazmy nebo séra. Stanovení z kapilární krve nebo ze vzorků DBS není pro tyto analyty standardem a nejsou pro ně k dispozici referenční hodnoty z důvodu odlišné kompozice plazmy/séra a kapilární krve. Bylo zjištěno, že odběrové DBS sorbenty uvolňují do výsledného eluátu mnohé ionty, které mohou eluát kontaminovat, a spolu s vlivem hematokritu krve a zadržováním cílových analytů mohou negativně ovlivňovat kvantitativní analýzu DBS vzorků. Z těchto důvodů se diplomová práce zabývá návrhem alternativního konceptu odběru DBS, který by eliminoval využití odběrových sorbentů a zajistil přesné odběry definovaného objemu krve. Experimentální část se zaměřuje na stanovení vybraných anorganických a organických iontů (NH4+, K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Cl, NO3, NO2, SO42, mravenčanů, laktátů a octanů) metodou kapilární elektroforézy s bezkontaktní vodivostní detekcí (CE-C4D). Všechny tyto ionty jsou obsaženy v krvi a současně se mohou uvolňovat jako kontaminanty z odběrových DBS sorbentů. Pro bezsorbentové odběry DBS byla použita neporézní polypropylenová vialka. Do této vialky byla přenesena malá kapka krve o přesném objemu (např. 5 l), která byla následně přímo ve vialce usušena. Zvolená vialka je vhodná pro přímou eluci DBS i analýzu DBS eluátu a je plně kompatibilní s dávkovacími systémy komerčních CE přístrojů. Navržený koncept bezsorbentových odběrů krve eliminoval nežádoucí kontaminaci a ukázal se vhodný pro stanovení testovaných kationtů a aniontů. Stabilita aniontů byla obecně nižší než stabilita kationtů, ale v porovnání se standardně používanými odběrovými sorbenty byla stále výrazně lepší. Stanovení některých aniontů se ukázalo jako přijatelné pouze v době 0–48 hodin po zaschnutí bezsorbentového DBS vzorku (skladovaného při laboratorní teplotě), jelikož docházelo k průběžnému zvyšování jejich obsahu. To bylo pravděpodobně způsobeno mikrobiálním rozkladem krevní matrice. Bylo ověřeno, že tento nárust může být zpomalen uchováváním bezsorbentových vzorků DBS při nízkých teplotách. Pro bezsorbentové DBS vzorky byly navrženy různé postupy odběrů krve, které jsou jednoduché, ekonomické, pohodlné a opakovatelné a jsou tedy vhodné jak pro domácí samoodběry, tak i pro odběry ve zdravotnických centrech. Jedná se o základní pilotní studii aplikovanou pouze na vybrané analyty, které sloužily jako modelový příklad. Pro rozvoj tohoto směru budou v návaznosti na tuto diplomovou práci pokračovat další obsáhlejší vědecké studie tohoto nově navrženého konceptu.
|
|
|
Nízkonákladové mikroextrakční a prekoncentrační postupy pro biomedicínské aplikace
Vašátko, Jan ; Diviš, Pavel (oponent) ; Dvořák, Miloš (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá vývojem nízkonákladových mikroextrakčních technik a jejich aplikací pro přečistění a prekoncentraci biologických vzorků, konkrétně experimentálním studiem extrakcí přes kapalnou membránu zakotvenou na pevném nosiči (SLM). Vyvinutá mikroextrakční technika využívá jako extrakční jednotky komerčně dostupné filtrační destičky a umožňuje extrakci bazických léčiv z biologických vzorků moči a krve (ve formě suchých krevních teček). Praktická část se zabývá optimalizací podmínek mikroextrakce bazických léčiv z reálných vzorků přes SLM v in-line spojení s laboratorní kapilární elektroforézou. Základní optimalizace podmínek mikroextrakce zahrnovala výběr vhodné organické fáze pro impregnaci membrány (směs ENB a DHE v poměru 1:1), vhodných otáček třepačky pro agitaci vzorku během extrakce (1000 rpm) a optimální poměr objemů donoru a akceptoru pro nejvyšší míru zakoncentrování analytů (400:15 µl). Po základní optimalizaci byl dále zkoumán vliv alkalizace donoru pomocí NaOH na extrakční výtěžnost (ER). U všech použitých matric (fyziologický roztok, neředěné vzorky lidské moči, lidská kapilární krev eluovaná ze suchých krevních teček deionizovanou vodou) bylo nejvyšších hodnot ER dosaženo při použití neutrálního donoru a okyseleného akceptoru. Doba extrakce (60 minut) byla optimalizována na základě časového průběhu mikroextrakce po dobu 120 minut. Takto optimalizovaná mikroextrakční technika je vhodná pro stanovení bazických léčiv v reálných matricích s dosažením dostatečné míry přečistění, prekoncentrace i hodnot ER.
|
|
|
Využití kapilární elektroforézy v analýze suchých krevních skvrn
Ryšavá, Lenka ; Tůma,, Petr (oponent) ; Petr,, Jan (oponent) ; Kubáň, Pavel (vedoucí práce)
Krevní vzorky jsou standardně analyzovány ve formě plazmy nebo séra. Jako alternativa pro vzorkování a skladování krve se stále častěji uplatňují suché krevní skvrny (DBS). V předložené disertační práci jsou DBS zpracovány a analyzovány kapilární elektroforézou (CE), která byla v minulosti pro analýzu DBS využívána velmi zřídka. Nicméně CE nabízí mnohé výhody, dané vývojem této techniky v poslední době, kterými standardní analytické metody nedisponují. Přímé spojení CE s mikroextrakčními technikami a simultánní stanovení analytů přítomných v komplexních matricích vede k minimalizaci nebo eliminaci nedostatků DBS analýz jako jsou například vliv matrice, vliv hematokritu a nehomogenní distribuce analytů v DBS. V nejjednodušším možném uspořádání je dosaženo úpravy, dávkování a analýzy DBS vzorků výhradně komerční CE. Vývojem nových plně rozpustných vzorkovacích materiálů pro DBS je dosaženo lepších extrakčních vlastností a kvantitativních výsledků. Vyvinuté postupy zahrnují nové metody pro účinnou úpravu DBS vzorků a jejich přímou analýzu bez nutnosti zásahu operátora a dosahují dostatečnou selektivitu a citlivost pro stanovení významných analytů nejenom v DBS, ale i v dalších vzorcích se složitými matricemi.
|
|
|
Pathology and physiology of de novo purine synthesis.
Krijt, Matyáš ; Zikánová, Marie (vedoucí práce) ; Šebesta, Ivan (oponent) ; Čajka, Tomáš (oponent)
Puriny jsou organické sloučeniny s rozmanitými funkcemi, které se nacházejí ve všech živých organismech ve složitých molekulách, jako jsou nukleotidy, nukleosidy nebo jako purinové báze. Jejich přirozená rovnováha v organismu je udržována syntézou, recyklací a degradací. Přebytek purinů se vylučuje močí jako kyselina močová. Purinové nukleotidy mohou být recyklovány záchrannými cestami, které katalyzují reakci purinové báze s fosforibosylpyrofosfátem. Zcela nová ústřední molekula purinového metabolismu, inosinmonofosfát, může být syntetizována z prekurzorů při de novo purinové syntéze (DNPS), která je aktivována v případech zvýšené potřeby purinů jako je např. vývoj organismu. DNPS zahrnuje deset kroků katalyzovaných šesti enzymy, které formují multienzymový komplex purinosom umožňující tok substrátů skrz tuto dráhu. Dosud byly popsány tři poruchy DNPS: deficit ADSL, AICA-ribosidurie a deficit PAICS. Všechny tři poruchy jsou způsobeny genetickými mutacemi vedoucími ke špatné funkci příslušného enzymu, které se dále projevují nedostatečnou aktivitou daného kroku DNPS. Biochemicky to znamená akumulaci substrátu poškozeného enzymu, biologicky narušení formování purinosomu a klinicky nespecifická neurologická postižení, což přispívá k problematické diagnostice poruch DNPS. Předpokládali jsme, že...
|
|
|
Nízkonákladové mikroextrakční a prekoncentrační postupy pro biomedicínské aplikace
Vašátko, Jan ; Diviš, Pavel (oponent) ; Dvořák, Miloš (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá vývojem nízkonákladových mikroextrakčních technik a jejich aplikací pro přečistění a prekoncentraci biologických vzorků, konkrétně experimentálním studiem extrakcí přes kapalnou membránu zakotvenou na pevném nosiči (SLM). Vyvinutá mikroextrakční technika využívá jako extrakční jednotky komerčně dostupné filtrační destičky a umožňuje extrakci bazických léčiv z biologických vzorků moči a krve (ve formě suchých krevních teček). Praktická část se zabývá optimalizací podmínek mikroextrakce bazických léčiv z reálných vzorků přes SLM v in-line spojení s laboratorní kapilární elektroforézou. Základní optimalizace podmínek mikroextrakce zahrnovala výběr vhodné organické fáze pro impregnaci membrány (směs ENB a DHE v poměru 1:1), vhodných otáček třepačky pro agitaci vzorku během extrakce (1000 rpm) a optimální poměr objemů donoru a akceptoru pro nejvyšší míru zakoncentrování analytů (400:15 µl). Po základní optimalizaci byl dále zkoumán vliv alkalizace donoru pomocí NaOH na extrakční výtěžnost (ER). U všech použitých matric (fyziologický roztok, neředěné vzorky lidské moči, lidská kapilární krev eluovaná ze suchých krevních teček deionizovanou vodou) bylo nejvyšších hodnot ER dosaženo při použití neutrálního donoru a okyseleného akceptoru. Doba extrakce (60 minut) byla optimalizována na základě časového průběhu mikroextrakce po dobu 120 minut. Takto optimalizovaná mikroextrakční technika je vhodná pro stanovení bazických léčiv v reálných matricích s dosažením dostatečné míry přečistění, prekoncentrace i hodnot ER.
|
|
|
Hollow fibre-liquid phase microextraction of basic drugs from dried dried blood spots
Dvořák, Miloš ; Miková, B. ; Šlampová, Andrea ; Kubáň, Pavel
Hollow fibre-liquid phase microextraction (HF-LPME) was applied for rapid and efficient extraction of basic drugs from dried blood spots (DBS). Basic drugs from DBS were first extracted into 10 mM NaOH solution, which acted as the HF-LPME donor solution, and simultaneously the neutralized drugs were transferred across the HF and preconcentrated in 10 mM HCl acceptor solution inside the HF lumen. Mixture (1:1, v:v) of 1-ethyl-2-nitrobenzene and dihexyl ether was used for impregnation of the porous HF membrane. Analytes in the acceptor solution were injected directly from the HF into capillary electrophoresis instrument for further separation, detection and quantification. Repeatability of the hyphenated analytical system ranged from 9.8 to 13.8 % (RSD) and enrichment factors of 52 – 78 were obtained for model basic drugs spiked to DBS extracts at a concentration level of 0.1 mg/L.
|
host ::
RSS.