|
|
Identifikace PHA produkujících bakterií pomocí nástrojů molekulární biologie
Gajdová, Barbora ; Obručová,, Hana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá identifikací bakterií, které jsou schopny produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA). Mezi testovanými bakteriemi byli převážně zástupci rodu Pseudomonas, Lactobacillus, Bifidobacterium, dále vzorky z termofilní kultury a vzorky z přírodních zdrojů. Bakterie byly testovány pomocí molekulárně biologické metody PCR. Byla analyzována amplifikace genu kódujícího PHA syntázu (phaC). V první reakci byl detekován jak phaC gen zodpovědný za syntézu PHA, tak současně i 16S rRNA, který slouží jako ověření bakteriální DNA a u neznámých vzorků z přírodních zdrojů sloužil také jako způsob identifikace konkrétního kmenu. Jednalo se o multiplexní PCR, která využívala více primerů ve směsi pro PCR. Druhou reakcí byl hledán amplikon, který je specifický pro syntázu, jež katalyzuje biosyntézu mcl-PHA (phaC1). Přítomnost genu pro tvorbu PHA syntázy byla prokázána u 11 vzorků a těmi byly Bifidobacterium breve CCM 7825T, Lactobacillus rhamnosus CCM 1825T, Lactobacillus zeae CCM 7069T, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CCM 7190T, Lactobacillus plantarum CCM 7039T, Pseudomonas gessardii, Pseudomonas fulva, Arthrobacter protophormiae, Curtobacterium flaccumfaciens, Mycobacterium neoaurum a Staphylococcus lentus.
|
|
|
Metody identifikace PHA produkujících bakterií
Skřivanová, Veronika ; Turková, Kristýna (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá testováním, optimalizací a porovnáním metod vhodných pro identifikaci bakterií produkujících polyhydroxyalkanoáty. V rámci práce byly využity metody kultivační a mikroskopické, kde byly bakteriální buňky barveny lipofilními barvivy Nilská červeň a Sudánová čerň. Dále byla využita průtoková cytometrie a metody spektroskopické, a to Ramanova spektroskopie a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací a také metody molekulárně biologické, kde byla analyzována přítomnost genu kódujícího PHA syntázu (phaC) pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). PCR test se skládá ze dvou reakcí, v první reakci je phaC gen amplifikován společně s 16S rRNA oblastí společnou pro všechny bakterie (multiplexní PCR). Druhá reakce je pak specifická pro PHA syntázu katalyzující biosyntézu mcl-PHA. Podle výsledků práce je při identifikaci PHA produkujících kmenů za účelem eliminace falešně pozitivních výsledků metod analyzujících genotyp a falešně negativních výsledků metod zkoumající fenotyp kombinovat oba přístupy. Jako velice perspektivní se jeví kombinace PCR pro stanovení přítomnosti phaC genu a následné analýzy přítomnosti PHA v bakteriálních buňkách. K tomuto účelu se nám nejlépe osvědčila Ramanova mikrospektroskopie, která je schopna zachytit i nízký obsah PHA v buňkách a zároveň nehrozí záměna PHA za jiné lipidické látky. Výsledky práce poskytují přehled testovaných metod, jejich výhody a nevýhody a také porovnání různých kritérií, dle kterých je možné vybrat metodu identifikace v závislosti na nastavených požadavcích.
|
|
|
Isolace PHA produkujících bakterií ze směsného mikrobiálního konsorcia
Plachý, Petr ; Kučera, Dan (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem této bakalářské práce byla detekce polyhydroxyalkanoáty (PHA) produkujících bakterií v aktivovaném kalu a pokus o izolaci těchto bakterií. Teoretická část se zabývá obecnou problematikou PHA a bakteriální produkce PHA. Pozornost je věnována také charakteristice aktivovaného kalu. Součástí teoretické části je i popis vybraných metod použitých k detekci PHA produkujících bakterií v této práci. V experimentální části byla směsná kultura aktivovaného kalu kultivována s využitím různých uhlíkových zdrojů v živném médiu. Ze získaných směsných kultur byly izolovány potenciální PHA produkující bakterie na základě lipofilního barvení Nilskou červení. Přítomnost genu phaC podmiňujícího tvorbu PHA byla detekována pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) u 11 vzorků. Sekvenací DNA izolované z těchto vzorků se podařilo identifikovat 8 z 11 vzorků. Jednalo se o bakterie Klebsiella pneumoniae (1 x), Paenirhodobacter enshiensis (1 x) a Pseudomonas putida (6 x). U dvou z 11 izolovaných kultur byla pomocí infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) prokázána přítomnost PHA v biomase. Polyhydroxybutyrát (PHB) byl stanoven pomocí plynové chromatografie na 9,33 % hmot. sušiny biomasy (Paenirhodobacter enshiensis) a 1,18 % (neidentifikovaná kultura).
|
|
|
Isolace PHA produkujících bakterií ze směsného mikrobiálního konsorcia
Plachý, Petr ; Kučera, Dan (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem této bakalářské práce byla detekce polyhydroxyalkanoáty (PHA) produkujících bakterií v aktivovaném kalu a pokus o izolaci těchto bakterií. Teoretická část se zabývá obecnou problematikou PHA a bakteriální produkce PHA. Pozornost je věnována také charakteristice aktivovaného kalu. Součástí teoretické části je i popis vybraných metod použitých k detekci PHA produkujících bakterií v této práci. V experimentální části byla směsná kultura aktivovaného kalu kultivována s využitím různých uhlíkových zdrojů v živném médiu. Ze získaných směsných kultur byly izolovány potenciální PHA produkující bakterie na základě lipofilního barvení Nilskou červení. Přítomnost genu phaC podmiňujícího tvorbu PHA byla detekována pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) u 11 vzorků. Sekvenací DNA izolované z těchto vzorků se podařilo identifikovat 8 z 11 vzorků. Jednalo se o bakterie Klebsiella pneumoniae (1 x), Paenirhodobacter enshiensis (1 x) a Pseudomonas putida (6 x). U dvou z 11 izolovaných kultur byla pomocí infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) prokázána přítomnost PHA v biomase. Polyhydroxybutyrát (PHB) byl stanoven pomocí plynové chromatografie na 9,33 % hmot. sušiny biomasy (Paenirhodobacter enshiensis) a 1,18 % (neidentifikovaná kultura).
|
|
|
Identifikace PHA produkujících bakterií pomocí nástrojů molekulární biologie
Gajdová, Barbora ; Obručová,, Hana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá identifikací bakterií, které jsou schopny produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA). Mezi testovanými bakteriemi byli převážně zástupci rodu Pseudomonas, Lactobacillus, Bifidobacterium, dále vzorky z termofilní kultury a vzorky z přírodních zdrojů. Bakterie byly testovány pomocí molekulárně biologické metody PCR. Byla analyzována amplifikace genu kódujícího PHA syntázu (phaC). V první reakci byl detekován jak phaC gen zodpovědný za syntézu PHA, tak současně i 16S rRNA, který slouží jako ověření bakteriální DNA a u neznámých vzorků z přírodních zdrojů sloužil také jako způsob identifikace konkrétního kmenu. Jednalo se o multiplexní PCR, která využívala více primerů ve směsi pro PCR. Druhou reakcí byl hledán amplikon, který je specifický pro syntázu, jež katalyzuje biosyntézu mcl-PHA (phaC1). Přítomnost genu pro tvorbu PHA syntázy byla prokázána u 11 vzorků a těmi byly Bifidobacterium breve CCM 7825T, Lactobacillus rhamnosus CCM 1825T, Lactobacillus zeae CCM 7069T, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CCM 7190T, Lactobacillus plantarum CCM 7039T, Pseudomonas gessardii, Pseudomonas fulva, Arthrobacter protophormiae, Curtobacterium flaccumfaciens, Mycobacterium neoaurum a Staphylococcus lentus.
|
|
|
Metody identifikace PHA produkujících bakterií
Skřivanová, Veronika ; Turková, Kristýna (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá testováním, optimalizací a porovnáním metod vhodných pro identifikaci bakterií produkujících polyhydroxyalkanoáty. V rámci práce byly využity metody kultivační a mikroskopické, kde byly bakteriální buňky barveny lipofilními barvivy Nilská červeň a Sudánová čerň. Dále byla využita průtoková cytometrie a metody spektroskopické, a to Ramanova spektroskopie a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací a také metody molekulárně biologické, kde byla analyzována přítomnost genu kódujícího PHA syntázu (phaC) pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). PCR test se skládá ze dvou reakcí, v první reakci je phaC gen amplifikován společně s 16S rRNA oblastí společnou pro všechny bakterie (multiplexní PCR). Druhá reakce je pak specifická pro PHA syntázu katalyzující biosyntézu mcl-PHA. Podle výsledků práce je při identifikaci PHA produkujících kmenů za účelem eliminace falešně pozitivních výsledků metod analyzujících genotyp a falešně negativních výsledků metod zkoumající fenotyp kombinovat oba přístupy. Jako velice perspektivní se jeví kombinace PCR pro stanovení přítomnosti phaC genu a následné analýzy přítomnosti PHA v bakteriálních buňkách. K tomuto účelu se nám nejlépe osvědčila Ramanova mikrospektroskopie, která je schopna zachytit i nízký obsah PHA v buňkách a zároveň nehrozí záměna PHA za jiné lipidické látky. Výsledky práce poskytují přehled testovaných metod, jejich výhody a nevýhody a také porovnání různých kritérií, dle kterých je možné vybrat metodu identifikace v závislosti na nastavených požadavcích.
|
host ::
RSS.