|
|
Proteolytické enzymy krevničky střevní (Schistosoma mansoni): patobiochemie a využití v biomedicíně
Leontovyč, Adrian ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevní motolice rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu, které postihuje celosvětově přes 250 milionů lidí a představuje spolu s malárii nejvýznamnější parazitózy. Vzhledem k nebezpečí vzniku rezistence k jedinému používanému léku jsou intenzivně hledány nové způsoby terapie schistosomózy. Proteolytické enzymy krevniček jsou klíčové pro jejich přežití v hostiteli, a proto jsou slibnými cílovými molekulami pro vývoj nových chemoterapeutik a vakcín. Tato práce se zabývá dvěma proteasami z krevničky střevní (Schistosoma mansoni), které byly připraveny jako rekombinantní proteiny a komplexně funkčně charakterizovány. První z nich je serinová proteasa SmSP2, která je lokalizovaná na povrchu dospělců a sekretovaná do krve hostitele. Byla identifikována jako vasodilatační a fibrinolytický faktor a navržena její modulační role při interakci parazita s hostitelem. Druhou zkoumanou proteasou je cysteinový katepsin SmCL3, který se účastní trávení hostitelských krevních proteinů sloužících krevničkám jako zdroj živin. Byly identifikovány účinné peptidomimetické inhibitory SmCL3, u nichž byla prokázána antischistosomální aktivita v testech s živými parazity. Disertační práce přináší nové významné poznatky o proteasách krevničky S. mansoni, jejich patobiochemii a inhibiční...
|
|
|
Biologicky aktivní látky vybraných modelových motolic
Kurečka, Martin ; Kameník, Zdeněk (vedoucí práce) ; Mikeš, Libor (oponent)
Motolice (Trematoda) jsou paraziti známí pro svou schopnost manipulovat se svým hostitelem za cílem přežití a reprodukce. Mají složité vývojové cykly, zahrnující mezihostitele, kterým je měkkýš, a definitivního hostitele, kterým jsou obratlovci. Tato práce se zaměřuje na tři medicínsky významné rody motolic: Schistosoma, Fasciola a Opisthorchis. Tato práce je sumarizuje biologicky aktivní nízkomolekulární látky, které parazit moduluje nebo produkuje za cílem manipulace svého hostitele. Výsledkem práce je literární rešerše srovnávající změny trendu koncentrace jednotlivých metabolitů nakažených a nenakažených hostitelů trematod se zaměřením na použitou analytickou metodu. Komplexní analýzou metabolismu biologických vzorků se zabývá metabolomika, která využívá spektroskopické analytické metody, jakými jsou například nukleární magnetická rezonance a hmotnostní spektrometrie spojená s plynovou nebo kapalinovou chromatografií. Součástí práce je také shrnutí významu, vývoje a perspektivy metabolického profilování v parazitologii. Současný výzkum v této oblasti se věnuje převážně obratlovčím hostitelům motolic. Navíc, zatímco u obratlovčích hostitelů je souhrn látek širší, u měkkýších mezihostitelů se studie zaměřovaly na rozdílný typ látek, a to převážně na metalické ionty a aminy. Proto je srovnání...
|
|
|
Inhibitory Kunitzova typu u Eudiplozoon nipponicum
Černíková, Markéta ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Jedličková, Lucie (oponent)
Proteiny obsahující Kunitz domény jsou nejčastěji inhibitory serinových proteáz. Jejich obecnou charakteristikou je přítomnost tří disulfidových vazeb a relativně malá velikost kolem 6-10 kDa, ale nezřídka se objevují velké proteiny s několika Kunitz doménami nebo jsou tyto domény součástí komplexnějších proteinů. Jejich funkce obvykle souvisí s regulací fyziologických a proteolytických procesů, ale i s interakcí s patogeny nebo jinými obrannými mechanismy, např. jako součást hlenu sasanek nebo jedu hadů a jiných bezobratlých živočichů. Zaměřili jsme se na Kunitz proteiny u Eudiplozoon nipponicum, parazita třídy Monogenea ze žaber kapra obecného (Cyprinus carpio). V transkriptomu tohoto parazita bylo identifikováno na základě podobnosti s již popsaným Kunitz proteinem EnKT1 několik dalších podobných sekvencí, z čehož lze usuzovat, že tento parazit využívá pro svou specifickou potravní strategii, podobně jako i jiní krevsající paraziti, celou sadu inhibitorů serinových proteáz s různými konkrétními funkcemi. Pomocí PCR bylo několik sekvencí s Kunitz doménou nalezených v transkriptomu ověřováno a případně doplněno pomocí RACE-PCR. Jeden protein, nazvaný EnKC1, byl následně produkován rekombinantně expresí v buňkách bakterie E. coli kmenů SHuffleTM a Rosetta Gami B. U rekombinantního proteinu s Kunitz...
|
|
|
Nové inhibiční mechanismy regulace aktivity katepsinu D
Hánová, Iva ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Aspartátová proteasa katepsin D (KatD) je spojená s řadou patologií, a proto jsou zkoumány molekulární mechanismy regulace její aktivity, které mají potenciální využití v biomedicíně. Tato disertační práce je zaměřena na nové přirozené endogenní inhibitory KatD, analýzu jejich interakce a na odvození syntetických inhibičních biomimetik. Byly identifikovány dvě skupiny inhibitorů KatD jako prvních specifických endogenních regulátorů tohoto enzymu. (1) Sfingolipidy jsou komplexními modulátory lidského KatD v závislosti na struktuře. Zatímco sfingosiny a ceramidy jsou inhibitory KatD, jejich fosforylované deriváty naopak fungují jako aktivátory KatD. Byla nalezena korelace mezi působením těchto sfingolipidů na KatD a jejich modulačním účinkem na nádorové buňky. (2) Analýzou KatD parazitárního původu byl identifikován nový mechanismus inhibice, který je konzervovaný u aspartátových proteas rodiny pepsinu. Autokatalytickým působením je z proenzymu KatD uvolněn peptidový fragment, který působí jako alosterický inhibitor, jenž se váže do exomísta na povrchu aktivního enzymu. Dále byly připraveny syntetické makrocyklické inhibitory lidského KatD, které mimikují vazebnou konformaci bakteriálního inhibitoru pepstatinu v aktivním místě aspartátových proteas. U těchto biomimetických inhibitorů lze na základě...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Parazitární proteáza SmCB2 jako cílová molekula pro léčbu schistosomózy
Bakardjieva, Marina ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevničky rodu Schistosoma jsou parazitické motolice, které způsobují schistosomózu, závažné onemocnění postihující více než 240 mil. lidí. Proteolytický systém krevniček je nezbytný pro jejich životaschopnost; účastní se důležitých procesů při interakci s hostitelem, jako je trávení potravy, invaze a migrace tkáněmi. Proto jsou proteázy krevniček perspektivními cílovými molekulami pro terapeutický zásah při léčbě schistosomózy. Tato práce se zabývá proteázou katepsin B2 (SmCB2) z krevničky střevní (S. mansoni), jejíž biochemické vlastnosti a biologická funkce nebyly podrobně studovány. Rekombinantní SmCB2 byl připraven pomocí kvasinkového a bakteriálního expresního systému a chromatograficky purifikován. V aktivitním testu in vitro byly identifikovány první účinné inhibitory SmCB2 blokující jeho proteolytickou aktivitu v submikromolárních koncentracích. Byly připraveny specifické polyklonální protilátky proti SmCB2, které byly použity pro imunomikroskopickou lokalizaci této proteázy v povrchové vrstvě parazita. Pomocí ELISA analýzy bylo zjištěno, že SmCB2 je rozeznáván jako parazitární antigen imunitním systémem hostitele v myším modelu schistosomózy. Práce přináší významné informace o SmCB2 jako potenciální cílové molekule pro syntetické inhibitory a jako novém antigenu pro vakcinační studie.
|
|
|
Antikoagulační faktory a příjem krve u monogeneí čeledi Diplozoidae
Skipalová, Karolína ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Sojka, Dan (oponent)
K úspěšnému přijímání potravy je pro hematofágní organismy nezbytná přítomnost antihemostatických molekul mezi které patří vasodilatační, antikoagulační molekuly a apyrázy. Přestože zástupci čeledi Diplozoidae (Heteronchoinea) sají krev na žábrách ryb, žádné podobné látky blokující hostitelskou hemostázu, u nich nebyly dosud identifikovány. Cílem této práce proto byla charakterizace molekul s potencionální antikoagulační aktivitou v homogenátu a exkrečně/sekrečních produktech (ESP) zástupců čeledi Diplozoidae. Dále pak provést bioinformatickou analýzu sekvencí získaných v transkriptomovém projektu Eudiplozoon nipponicum a vybrané proteiny (proteinové domény) získat v rekombinantní podobě. Inhibiční aktivita v ESP a homogenátech měřená proti koagulačním faktorům IIa a Xa spolu s jejich fluorogenními substráty byla prokázána pouze v jednou případě z pěti měření. Z 2 transkriptomového projektů jsme vyčlenily tři skupiny inhibitorů serinových proteáz - annexiny, serpiny, Kunitz-type protein, které by mohly patřit mezi kandidáty na inhibitory koagulační kaskády. Prací jsme zaměřili na inhibitory Kunitz typu, které se vyznačují přítomností vysoce konzervované doménu odpovídající za inhibici. Samotnou Kunitz doménu z vybraného proteinu jsme se následně pokusili exprimovat v rekombinantí formě v...
|
host ::
RSS.