|
|
Centrifugační analýza mikrobiálních buněk
Beránková, Barbora ; Müllerová, Lucie (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem centrifugačního potenciálu mikroorganismů v závislosti na kultivačních podmínkách. V experimentální části byla sledována především rychlost sedimentace a index nestability studovaných mikroorganismů během růstu, při působení teplotního a solného stresu, vliv složení média na centrifugaci a působení vody na halofilní bakterii Haloferax mediterranei. S klesající osmotickou sílou v bakteriální kultuře Haloferax mediterranei roste rychlost sedimentace a index nestability. Při sledování růstu bakterií Cupriavidus necator H16, Cupriavidus necator PHB-4, Haloferax mediterranei, Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari hraje roli při rychlosti sedimentace a indexu nestability přítomnost a typ polyhydroxyalkanoátu (PHA) v bakteriální biomase. Bakterie Cupriavidu necator H16 s nejvyšším přítomným obsahem poly(3-hydroxyburyrátu) byla nejrychleji sedimentující a nejvíce nestabilní ze sledovaných bakterií. Bakterie Cupriavidus necator H16 a její PHA neprodukující mutant Cupriavidus necator PHB-4, vystavené teplotnímu a solnému stresu, vykazovaly při teplotním stresu pouze nepatrný vliv na rychlost sedimentace a nestabilitu. U solného stresu s rostoucí koncentrací roztoku NaCl v kultuře klesala rychlost sedimentace a index nestability. Při porovnávání vlivu složení média na polyhydroxyalkanoáty (PHA) produkující bakterie, Cupriavidus necator H16 kultivovaná v minerálním (produkčním) médiu vykazovala nejnižší rychlost sedimentace a index nestability, přičemž Cupriavidus necator PHB-4 dosahovala nejnižší rychlosti sedimentace a indexu nestability při kultivaci v Nutrient Broth médiu. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae měla volba média pouze nepatrný vliv na rychlost sedimentace a index nestability.
|
|
|
Study on metabolism of polyhydroxybutyrate and glycogen in cyanobacteria
Drinka, Jakub ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
The submitted diploma thesis is focused on establishing a quantification method for glycogen analysis in cyanobacterial cells in order to be able to consider the impact of illumination and other parameters on accumulation of reserve polymers, glycogen and polyhydroxyalkanoates (PHA), namely poly(3-hydroxybutyrate) (PHB). The experiments were conducted with two cyanobacterial species, Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis salina CCALA 192, which were grown both in Erlenmayer flasks (EF) and multicultivator (MC). The methodology for glycogen accumulation was introduced based on available literature and conducted optimalization. The effect of different illumination conditions was observed in a nitrogen-limiting media M22O, in which half of the cultures were cultivated with a 16 hours of light and 8 lights of darkness periods (EF) for the whole duration of the experiment. Others were transfered into full-time dark period after entering the dormant chlorosis state, following the exhaustion of nitrogen levels in the media. Synechocystis sp. PCC 6803 showed a decrease in both of the reserve polymers accumulation when introduced to this type of stress conditions. On the other hand, Synechocystis salina CCALA 192 converted some of the glycogen into PHB in the dark, but the polyester levels were lower than those of the cultures continuously cultivated under the lamp. A negative effect on the biomass concentration was also detected, while cyanobacterial pigments seemed to be unaffected by the lack of light, their levels in the EF that remained illuminated decreased due to chrolosis. The experiments in the MC were conducted in the same way, but the light period consisted of constant, 24-hour illumination. Synechocystis sp. PCC 6803 seemed to follow a different trend than in cultivations in EF, the PHB concentration was not affected by the dark period and remained on the same amounts, while glycogen was metabolised. Synechocystis salina CCALA 192 increased its polyester reserves in the darkness and in comparison with the first species accumulated almost 4 times more PHB. However, the results acquired from cultivations in MC seemed to be very unequal due to a lot of small differences in the cultivation conditions. That was the reason why in the later stages of experiments they were focused more on a possible PHA copolymer formation, rather than comparing the functions of these two reserve polymers in the light/dark cycles. However, none of the cultivations was succesful in this matter and no monomer other than 3-hydroxybutyrate (3HB) was detected in the dried biomass.
|
|
|
Využití vibrační spektroskopie při in-situ kvalitativní a kvantitativní analýze polyhydroxyalkanoátů v bakteriální biomase
Kevélyová, Barbora ; Enev, Vojtěch (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Cieľom tejto bakalárskej práce bolo zhodnotiť využiteľnosť vybranej metódy vibračnej spektroskopie pre kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu biomasy, ktorá obsahuje polyhydroxyalkanoáty. Bola zvolená metóda infračervenej spektroskopie s Fourierovou transformáciou, ktorá využíva tzv. zoslabený úplný odraz (ATR-FTIR). Poly(3-hydroxybutyrát-co-4-hydroxybutyrát) bol skúmaný v baktériách Cupriavidus malaysiensis, Thermomonas hydrothermalis a Aneurinibacillus thermoaerophilus sp. H1. Vyhodnotením infračervených spektier boli získané dáta, ktoré sa následne porovnali s výsledkami prevedenej plynovej chromatografie. Boli tiež pozorované vizuálne zmeny v spektrách a stav kryštalinity. Pri kvantitatívnej analýze kopolyméru v biomase metódou ATR-FTIR nebola pozorovaná korelácia dát s výsledkami plynovej chromatografie. Táto metóda teda nie je vhodná pre stanovenie celkového obsahu poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) v biomase v prípade nami nastaveného experimentu a použitých baktérií. Na druhej strane bola daná metóda úspešne využitá pri kvalitatívnej analýze kopolyméru in-situ v biomase producenta Aneurinibacillus thermoaerophilus sp. H1. Miera korelácie dát bola v danom experimente dosť vysoká. ATR-FTIR je teda vhodná analytická metóda pre stanovenie monomérneho zloženia kopolyméru poly(3-hydroxybutyrát-co-4-hydroxybutyrát) priamo v biomase pri tejto baktérií. Porovnaním s producentom Cupriavidus malaysiensis sa ukázalo, že táto metóda nie je univerzálna pre všetky typy nami skúmaných mikroorganizmov.
|
|
|
Produkce polyhydroxyalkanoátů pomocí Haloferax mediterranei
Hlináková, Kristýna ; Kučera, Dan (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce je zaměřena na studium vybraných vlivů na produkci biopolymerů, polyhydroxyalkanoátu (PHA) a extracelulárních polysacharidů (EPS), extrémně halofilní Archae Haloferax mediterranei. V teoretické části je zpracována stručná charakteristika biopolymerů a přehled příslušných mikrobiálních producentů. Experimentální část byla zaměřena na výběr vhodného substrátu, koncentraci soli a glukózy v médiu pro optimální produkci biopolymerů. Dalšími studovanými vlivy byla přítomnost světla a vhodná kultivační teplota. Pro stanovení biomasy byla zvolena metoda UV-VIS spektrofotometrie a gravimetrická metoda. PHA byly analyzovány pomoci plynové chromatografie s FID detekcí. Konkrétním PHA, produkovaným pomoci H. mediterranei, je kopolymer P(3HB-co-3HV). Obsah 3HV v kopolymeru se pohybuje okolo 10 %. Pro produkci PHA se jako nejlepší substrát osvědčila směs glukózy a glycerolu, kdy bylo dosaženo až 80,6% PHA v sušině. Dále byla optimalizována osmotická síla prostředí, kde se z pohledu akumulace PHA nejlépe osvědčila koncentrace NaCl 200 g/l. Je zajímavé, že na různou iontovou sílu prostředí reagovala kultura odlišnou pigmentací. Posledním klíčovým parametrem, který byl optimalizován v rámci této práce, byla teplota. Nejvyšší výtěžek PHA byl zaznamenán při teplotě 37°C, nicméně kultura byla schopna růst a akumulovat PHA i při teplotě 50°C.
|
|
|
Využití fyzikálně-chemických analýz při studiu stresových odpovědí mikroorganismů
Slaninová, Eva ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá využitelností fyzikálně-chemických analýz při vlivu stresových faktorů na mikroorganismy, kde hlavní náplní této práce bylo navržení a následná optimalizace technik a metod, které jsou obecně využívány v odlišných oblastech vědy a výzkumu. Jako modelové mikroorganismy, podrobené fyzikálně-chemickým analýzám v experimentální části této práce, byly zvoleny dva bakteriální kmeny: Cupriavidus necator H16 a její mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4 lišící se schopností produkce polyhydroxyalkanoátů. Nejprve byly navrženy a otestovány mikroskopické techniky jako transmisní elektronová mikroskopie (TEM), kryo skenovací elektronová mikroskopie (kryo-SEM) a mikroskopie atomárních sil (AFM) sloužící k charakterizaci morfologických odlišností bakterií. Dále byly stanovovány a porovnávány viskoelastické vlastnosti bakterií prostřednictvím oscilačních testů metodou reologie, které byly rovněž otestovány a optimalizovány s ohledem na typ vzorků. Mezi další navržené a otestované fyzikálně-chemické metody patří termická analýza, konkrétně diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) a termogravimetrická analýza (TGA) zabývající se transportem vody a chování intracelulární vody s ohledem na vliv přítomných PHB granulí v bakteriích. Poslední technika, která byla zavedena a optimalizována, je použití dynamického a elektroforetického rozptylu při měnícím se pH, sloužící k charakterizaci povrchových vlastností bakterií (velikost, zeta potenciál, izoelektrický bod).
|
|
|
Příprava a aplikace částic z kopolymeru P(3HB-co-4HB)
Ostanina, Kseniia ; Sedláček, Petr (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá přípravou částic z kopolymeru poly(3-hydroxybutyrát-co-4-hydroxybutyrát). Postup je založen na rozpuštění kopolymeru v acetonu a jeho následném dávkování do anti-solventů, se kterými je aceton plně mísitelný. Teoretická část se zaměřuje na vlastnosti kopolymeru, jeho produkci a možné využití v medicínských aplikacích. V rámci experimentální části bylo vyzkoušeno kapání do vybraných anti-solventů pomocí stříkačky a pipety nad a pod hladinou kapaliny. Byly zvoleny následující anti-solventy: voda, 50 % roztok acetonu ve vodě, 75 % aceton ve vodě, methanol, 50 % methanol ve vodě, 75 % methanol ve vodě a dimethylsulfoxid (DMSO). Využívaly se tři kopolymery s různým podílem monomerních jednotek (63 %, 87 % a 33 % 4HB), který byl stanoven pomocí plynové chromatografie. Kopolymery byly získány kultivací bakteriálního kmenu Aneurinibacillus sp. H1. Výsledky svědčí o tom, že pomocí metod, popsaných v této práci, lze připravit částice o velikosti přibližně 100-500 nm. Vyrobené částice mohou být následně úspěšně využity v medicínských aplikacích.
|
|
|
Vliv akumulace PHA na stresovou odolnost bakterií vůči dezinfekčním prostředkům
Krupičková, Kristýna ; Fryšová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vlivem akumulace PHA na stresovou odolnost bakterií vůči dezinfekčním prostředkům. Jako modelové mikroorganismy, využité pro analýzy v experimentální části práce, byly zvoleny dva kmeny: PHA akumulující Cupriavidus necator H16 a její mutantní kmen neschopný PHA syntézy Cupriavidus necator PHB-4. Tyto bakterie byly exponovány třem vybraným dezinfekčním prostředkům (ethanol, savo a ajatin) o třech různých koncentracích. Byla stanovena viabilita bakterií při působení daných detergentů, a to plotnovou metodou a průtokovým cytometrem. Vliv dezinfekčních prostředků na bakterie byl dále zkoumán bujónovou diluční metodou, která spočívala v měření absorbance v čase. Poslední využitou technikou byla agarová difúzní metoda. Z výsledků je patrné, že produkce PHA pozitivně napomáhá obranyschopnosti buněk vůči dezinfekčním prostředkům, jelikož bakteriální kmen Cupriavidus necator H16 je více odolný než jeho mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4. Ze tří vybraných dezinfekčních prostředků je neúčinnější ajatin.
|
|
|
Analytical methods for qualitative and quantitative determination of PHA in cyanobacteria
Černayová, Diana ; Samek, Ota (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
The diploma thesis is confused to verify the applicability of selected physicochemical and spectroscopic methods for characterization of cyanobacteria, with special emphasis on possibilities of qualitative and quantitative analysis of polyhydroxyalkanoates (specifically polyhydroxybutyrate (PHB)) accumulated in cyanobacterial cells. The sample basis of the work was formed by cultures of cyanobacterial strains of Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechocystis salina CCALA 192. The cultures were were cultivated in several ways to cover the widest possible range of physiological conditions and PHB contents, in particular using an autotrophic way of cultivation on shakers and multicultural culture method in a basic culture medium,and in media enriched with 2% salt (NaCl ) as well as mixotrophic culture media with different types of the carbon substrate. After few weeks of cultivation, cyanobacterial cultures were obtained and complexly analyzed by following techniques- cell suspensions were analyzed by flow cytometry and UV-VIS spectrometry (transmission and diffusion transmission mode), dry cell biomass was characterised by gas chromatography to obtain a exact amount of PHB, and then FT-IR spectrometry and thermogravimetric analysis. The work aimed to assess whether any of these methods can be a quick and affordable alternative to the determination of PHB content to the most commonly used method of gas chromatography, but also to assess what additional information about the physiological state of cyanobacterial cells can provide test methods. The highest correlation on PHB content was determined for the parameters determined by infrared spectroscopy, in which specific peaks from the characteristic wavelengths for polyhydroxybutyrate were important. Weak correlations on PHB content were achieved in thermogravimetric analysis and cytometry, using the hydrophobic fluorescent probe BODIPY 439/503, which bound to lipophilic parts of cells. In addition to the determination of PHB, it was possible to determine pigments present in cyanobacteria (such as chlorophyll, phycocyanin and carotenoids) by flow cytometry and UV-VIS diffusion transmission spectrometry. In the end, results from all used techniques were compared by PCA analysis to determine the similarity of all analyzed samples.
|
|
|
Ramanova spektroskopie prokaryotních buněk
Večeríková, Paula ; Bernatová,, Silvie (oponent) ; Samek, Ota (vedoucí práce)
Predkladaná bakalárska práca sa zaoberá Ramanovou spektroskopiou bakteriálnych buniek. Táto metóda sa ukazuje ako veľmi vhodná na sledovanie kultivačných podmienok týchto bakteriálnych kmeňov, pretože je vo svojej podstate nedeštruktívna a rýchla v porovnaní s plynovou chromatografiou. Vďaka nedeštruktívnemu charakteru je možné zmerané bunky ďalej kultivovať. Túto analytickú metódu je ďalej možné využiť k triedeniu a výberu jedincov so zvýšenou schopnosťou tvorby PHB. Týmto výberom by bolo potom možné vybrať generáciu tzv. superproducentov PHB. Polyhydroxybutyrát (PHB) patrí do skupiny polyhdroxyalkanoátov (PHA), ktoré slúžia ako náhrada plastov z petrochemického priemyslu, ktorých spotreba narastá obzvlášť v dobe pandémie. Súčasne biodegradabilné náhrady sú na báze škrobu, čím však dochádza ku odčerpávaniu nutričného materiálu pre ľudí a zvieratá. Táto bakalárska práca môže slúžiť ako podklad ku zníženiu ceny výroby PHB, keďže výsledky môžu byť použité pri kultivácií buniek ako senzor obsahu PHB v reakcií na kmeň baktérií. V experimentálnej časti práce boli premerané Ramanové spektrá vybraných baktérií, kde výsledok ukázal najväčšiu odozvu pre PHB u Chelatococcus shambunathi a najnižšiu u termofilný izolát BZ (Paenibacillus sp.). Kvantitatívna informácia o obsahu PHA v baktériách bola zistená plynovou chromatografiou, kde najvyšší obsah mala baktéria – Chelatococcus shambunathi a naopak najnižší Termobacillus composti. Predmetom druhej časti bolo oddelenie zmesi dvoch bakteriálnych kultúr produkujúcich a neprodukujúcich PHA. Výsledkom bol jednoznačný dôkaz, že zmes je oddeliteľná na základe intenzity vybraného triediaceho parametra.
|
|
|
Studium zapojení polyhydroxyalkanoátů do stresové odpovědi mikroorganismů
Kučera, Dan ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem práce bylo studium zapojení polyhydroxyalkonoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií. Teoretická část bakalářské práce se zabývá možností stanovení viability mikroorganismů s využitím moderních technik, především průtokové cytometrie. Dále pak byla zpracována rešerše zaměřená na vybrané stresové faktory a zapojení PHA do stresové odpovědi. V experimentální části práce byla posuzována stresová odpověď v souvislosti se schopností akumulovat PHA. Tomuto experimentu posloužila bakterie Cupravidus necator. Schopnost akumulace PHA v pozdější fázi růstové křivky navyšuje odolnost vůči ethanolu, vysoké teplotě a mražení. Naopak nižší odolnost jevil kmen produkující PHA při působení anorganickými kyselinami a zásadami. Důvodem může být odlišná morfologie PHA produkujících buněk. Dílčím cílem bylo i studium možnosti barvení živých buněk akumulujících PHA pomocí Nilské červeně. Studium ukázalo, že barvivo penetruje do živých buněk při teplotě zvýšené na 40-45 °C. Tato teplota není pro buňky letální a intenzita barvení je dostatečná k odlišení PHA produkujících buněk pomocí průtokové cytometrie, což může mít využití při selekci průmyslových producentů PHA.
|
host ::
RSS.