|
| |
|
|
Zavedení afinitní separace do purifikačního protokolu lidských membránově vázaných enzymů redukujícících karbonylové sloučeniny
Štýbnarová, Radka ; Zemanová, Lucie (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Radka Štýbnarová Školitel: RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D. Název diplomové práce: Zavedení afinitní separace do purifikačního protokolu lidských membránově vázaných enzymů redukujících karbonylové sloučeniny Karbonyl-redukující enzymy hrají důležitou roli v metabolismu mnohých eobiotik (steroidů, prostaglandinů) i xenobiotik (doxorubicinu, daunorubicinu, oracinu, NNK, haloperidolu). Vzhledem k jejich substrátové specifitě hrají také důležitou roli ve vývoji některých onemocnění, jako je rakovina závislá na hormonech nebo metabolický syndrom. Zatímco cytosolické karbonyl-redukující enzymy jsou dobře charakterizovány, informací o membránově vázaných je vzhledem k jejich náročnému studování podstatně méně. V současnosti jsou popsány pouze tři mikrosomální karbonyl-redukující enzymy účastnící se metabolismu xenobiotik (11β-HSD1, DHRS7 and DHRS3), z nichž pouze 11β-HSD1 je dobře charakterizována. Nicméně, na základě výzkumu protinádorového léčiva oracinu a jeho stereospecifity redukce se předpokládá existence dalších mikrosomálních karbonyl-redukujících enzymů, účastnících se jeho metabolismu a inaktivace. Abychom mohli izolovat tyto "neznámé" enzymy, byl vyvinut afinitní nosič s imobilizovaným ligandem...
|
|
|
Purifikace a charakterizace vybrané lidské mikrosomální reduktasy
Skarka, Adam ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Živná, Lucie (oponent)
Oblast lidských jaterních mikrosomálních reduktas není ještě ani zdaleka prozkoumána. Purifikace a charakterizace dosud nepopsaných enzymů je důležitým krokem k dokončení tohoto úkolu. V mé práci je popsána separace a purifikace těchto reduktas s využitím hydrofobně- interakční chromatografie na nízkotlakém chromatografickém přístroji ÄKTA purifier. Použity byly dvě kolony s různým substrátem, Fenyl sepharosa (low sub) a Oktyl sepharosa. Podmínky separace byly v obou případech nastaveny shodně. Výsledky získané inkubací jednotlivých frakcí a následným měřením na HPLC jednoznačně prokázaly rozdíly mezi oběma kolonami a jejich substráty. Nelze ovšem jednoznačně určit, která kolona je pro purifikaci vhodnější, protože stále zbývá velký prostor pro úpravu a optimalizaci purifikačních podmínek.
|
|
|
Characterization of human warfarin reductase
Sokolová, Simona ; Malátková, Petra (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Simona Sokolová Školiteľ: PharmDr. Petra Malátková, Ph.D. Názov diplomovej práce: Charakterizácia ľudskej warfarin reduktázy Warfarin je v súčasnosti terapeuticky široko používané antikoagulačné liečivo. Vzhľadom na úzke terapeutické okno warfarinu je dôležité kompletne poznať jeho metabolizmus v ľudskom tele. Na metabolizme warfarinu sa podieľajú oxidačné, redukčné a konjugačné reakcie. Redukčný metabolizmus warfarinu zatiaľ nebol podrobne študovaný. Premenou postrannej karbonylovej skupiny warfarinu vzniká redukovaný metabolit warfarin-alkohol. Je známe, že ľudské cytosolické a mikrozomálne frakcie vykazujú redukčnú aktivitu voči warfarinu, ale konkrétne enzýmy katalyzujúce redukciu nie sú zatiaľ známe. Cieľom tejto práce bolo identifikovať enzým/enzýmy podieľajúce sa na redukcii warfarinu a stanoviť kinetiku redukčných premien. Ľudká cytosolická a mikrozomálna pečeňová frakcia a rekombinantné enzýmy AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, AKR1C4, CBR1 a CBR3 boli inkubované s warfarinom o rôznych koncentráciách. UHPLC kvantifikáciou vzniknutého warfarin-alkoholu boli stanovené špecifické aktivity jednotlivých enzýmov a frakcií. Bola potvrdená aktivita cytosolickej a mikrozomálnej...
|
|
|
Characterization of human warfarin reductase
Sokolová, Simona ; Malátková, Petra (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Simona Sokolová Školiteľ: PharmDr. Petra Malátková, Ph.D. Názov diplomovej práce: Charakterizácia ľudskej warfarin reduktázy Warfarin je v súčasnosti terapeuticky široko používané antikoagulačné liečivo. Vzhľadom na úzke terapeutické okno warfarinu je dôležité kompletne poznať jeho metabolizmus v ľudskom tele. Na metabolizme warfarinu sa podieľajú oxidačné, redukčné a konjugačné reakcie. Redukčný metabolizmus warfarinu zatiaľ nebol podrobne študovaný. Premenou postrannej karbonylovej skupiny warfarinu vzniká redukovaný metabolit warfarin-alkohol. Je známe, že ľudské cytosolické a mikrozomálne frakcie vykazujú redukčnú aktivitu voči warfarinu, ale konkrétne enzýmy katalyzujúce redukciu nie sú zatiaľ známe. Cieľom tejto práce bolo identifikovať enzým/enzýmy podieľajúce sa na redukcii warfarinu a stanoviť kinetiku redukčných premien. Ľudká cytosolická a mikrozomálna pečeňová frakcia a rekombinantné enzýmy AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, AKR1C4, CBR1 a CBR3 boli inkubované s warfarinom o rôznych koncentráciách. UHPLC kvantifikáciou vzniknutého warfarin-alkoholu boli stanovené špecifické aktivity jednotlivých enzýmov a frakcií. Bola potvrdená aktivita cytosolickej a mikrozomálnej...
|
|
|
Validace metody stanovení amiodaronu a jeho metabolitu pomocí HPLC
Prudková, Marie ; Dršata, Jaroslav (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Tato diplomová práce se zabývá zavedením kvantitativního stanovení amiodaronu a jeho metabolitu desethylamiodaronu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s UV detekcí s využitím vnitřního standardu dronedaronu a ověřením jejího použití při analýze vzorků pacientů. V teoretické části je řešena problematika amiodaronu a kapalinové chromatografie a možnosti stanovení této látky různými metodami. V experimentální části je popsán postup analýzy amiodaronu a desethylamiodaronu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie a validace této metody, zahrnující parametry LOD, LOQ, linearitu, pracovní rozsah, preciznost a výtěžnost (recovery). Závěrem práce jsou srovnány dva způsoby hodnocení výsledků analýzy na souboru 41 pacientů. Validačními parametry byla ověřena spolehlivost analytického postupu.
|
|
|
Biotransformace vybraných anthelmintik u vlasovky slezové
Sečkařová, Anna ; Raisová Stuchlíková, Lucie (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Anna Sečkařová Školitel: RNDr. Lucie Raisová Stuchlíková, Ph.D. Název diplomové práce: Biotransformace vybraných anthelmintik u vlasovky slezové Rezistence na benzimidazolová anthelmintika je jeden z hlavních problémů, se kterými se potýká chov malých přežvýkavců. Nejproblematičtějším parazitem ovcí a koz je krevsající vlasovka slezová (Haemonchus contortus), která každoročně způsobuje obrovské ztráty. Cílem této práce bylo studium metabolismu vybraných benzimidazolů (albendazol, ABZ, rikobendazol, RCB a flubendazol, FLU) u vlasovky slezové. Byl porovnáván metabolismus samců a samic a dále citlivý kmen ISE (Inbred Susceptible Edinburgh, MHco3) s rezistentním kmenem IRE (Inbred Resistant Edingburgh, MHco5). Pro detekci metabolitů byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (UHPLC/MS). Bylo identifikováno 12 metabolitů FLU, 9 metabolitů ABZ a 7 metabolitů RCB. Na základě identifikovaných metabolitů byla navržena metabolická schémata. Při porovnávání metabolismu byly nalezeny významné rozdíly mezi pohlavími i mezi kmeny. Samice testovaná anthelmintika metabolizovaly intenzivněji než samci. Několik metabolitů bylo identifikováno pouze u samic rezistentního...
|
|
|
Zavedení afinitní separace do purifikačního protokolu lidských membránově vázaných enzymů redukujícících karbonylové sloučeniny
Štýbnarová, Radka ; Zemanová, Lucie (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Radka Štýbnarová Školitel: RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D. Název diplomové práce: Zavedení afinitní separace do purifikačního protokolu lidských membránově vázaných enzymů redukujících karbonylové sloučeniny Karbonyl-redukující enzymy hrají důležitou roli v metabolismu mnohých eobiotik (steroidů, prostaglandinů) i xenobiotik (doxorubicinu, daunorubicinu, oracinu, NNK, haloperidolu). Vzhledem k jejich substrátové specifitě hrají také důležitou roli ve vývoji některých onemocnění, jako je rakovina závislá na hormonech nebo metabolický syndrom. Zatímco cytosolické karbonyl-redukující enzymy jsou dobře charakterizovány, informací o membránově vázaných je vzhledem k jejich náročnému studování podstatně méně. V současnosti jsou popsány pouze tři mikrosomální karbonyl-redukující enzymy účastnící se metabolismu xenobiotik (11β-HSD1, DHRS7 and DHRS3), z nichž pouze 11β-HSD1 je dobře charakterizována. Nicméně, na základě výzkumu protinádorového léčiva oracinu a jeho stereospecifity redukce se předpokládá existence dalších mikrosomálních karbonyl-redukujících enzymů, účastnících se jeho metabolismu a inaktivace. Abychom mohli izolovat tyto "neznámé" enzymy, byl vyvinut afinitní nosič s imobilizovaným ligandem...
|
|
|
Characterization of human warfarin reductase
Sokolová, Simona ; Malátková, Petra (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Simona Sokolová Školiteľ: PharmDr. Petra Malátková, Ph.D. Názov diplomovej práce: Charakterizácia ľudskej warfarin reduktázy Warfarin je v súčasnosti terapeuticky široko používané antikoagulačné liečivo. Vzhľadom na úzke terapeutické okno warfarinu je dôležité kompletne poznať jeho metabolizmus v ľudskom tele. Na metabolizme warfarinu sa podieľajú oxidačné, redukčné a konjugačné reakcie. Redukčný metabolizmus warfarinu zatiaľ nebol podrobne študovaný. Premenou postrannej karbonylovej skupiny warfarinu vzniká redukovaný metabolit warfarin-alkohol. Je známe, že ľudské cytosolické a mikrozomálne frakcie vykazujú redukčnú aktivitu voči warfarinu, ale konkrétne enzýmy katalyzujúce redukciu nie sú zatiaľ známe. Cieľom tejto práce bolo identifikovať enzým/enzýmy podieľajúce sa na redukcii warfarinu a stanoviť kinetiku redukčných premien. Ľudká cytosolická a mikrozomálna pečeňová frakcia a rekombinantné enzýmy AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, AKR1C4, CBR1 a CBR3 boli inkubované s warfarinom o rôznych koncentráciách. UHPLC kvantifikáciou vzniknutého warfarin-alkoholu boli stanovené špecifické aktivity jednotlivých enzýmov a frakcií. Bola potvrdená aktivita cytosolickej a mikrozomálnej...
|
|
|
Cell-free expression of a voltage-gated sodium channel for future 2D IR spectroscopic studies
Kovácsová, Gabriela ; Skálová, Lenka (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Gabriela Kovácsová Školitel: Dr. Sebastian Peuker, Prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D. Název diplomové práce: Bezbuněčná exprese napěťově řízeného sodíkového kanálu pro budoucí 2D IR spektroskopické studie Napěťově řízené sodíkové kanály (Nav), membránové proteiny z nadrodiny napěťově řízených iontových kanálů, jsou součástí každé excitabilní buňky, kde se podílejí na propagaci akčních potenciálů změnou propustnosti její membrány pro sodíkové ionty. Eukaryotní Nav jsou tvořeny jedním pseudo-homotetramerickým polypeptidem, ve kterém se čtyřikrát opakuje šest transmembránových segmentů (S1-S6). S1-S4 tvoří napěťový senzor reagující na změny napětí na membráně a S5 spolu s S6 tvoří samotný pór kanálu, na jehož extracelulárním ústí je selektivní filtr rozeznávající sodíkové ionty. Zatímco iontová selektivita napěťově řízených draselných kanálů byla detailně popsána na molekulární úrovni, málo je známo o principu selektivity u Nav. Studie selektivního filtru pomocí 2D IR spektroskopie, což je metoda schopná poskytnout strukturní informace o daných vazebných interakcích s časovým rozlišením na pikosekundy až milisekundy, vyžaduje velké množství vyčištěného proteinu. To je těžké získat v případě eukaryotních...
|
host ::
RSS.