|
|
Využití magnetických nano- a mikro částic při izolaci DNA z vybraných druhů potravin
Ráčková, Lucie ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
V práci byla ověřována mikrometoda izolace rostlinné DNA z vybraných druhů zeleniny (cibule, brokolice) a potravinových výrobků v kvalitě vhodné pro konvenční polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Mikrometoda umožňuje izolaci DNA pomocí magnetických nosičů z hrubých lyzátů buněk, získaných přímou homogenizací rostlinných tkání. Byly porovnávány různé způsoby zpracování homogenátů. Homogenizace probíhala v lyzačním pufru s obsahem cetyltrimetylamoniumbromidu (CTAB). Byl testován vliv organických extrakčních činidel chloroform-oktanolu a isopropanolu. Z homogenátů byla DNA purifikována reverzibilní adsorpcí na magnetické částice. Byly testovány celkem čtyři různé typy magnetických částic. U izolovaných DNA bylo provedeno spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty. Amplifikovatelnost DNA byla ověřena pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Byly použity dvě sady specifických primerů pro rostlinnou ribosomální DNA (rDNA). Produkty PCR dlouhé 700 a 220 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Byly prokázány rozdíly ve výtěžku a kvalitě DNA v závislosti na způsobu zpracování homogenátů a použitých magnetických nosičích. Navržený postup s dvěma nosiči byl testován pro izolaci DNA z potravinových výrobků obsahujících rostlinný materiál (rostlinné pomazánky). DNA se amplifikovala v PCR. Mikrometoda je vhodná pro DNA analýzu potravin.
|
|
|
The application of magnetic particles for DNA isolation from selected vegetable products
Akwari, Michala ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Micromethod of DNA isolation using magnetic particles is one of the modern technological methods used in DNA isolation, and makes the process simpler, more effective and faster. The main aim of this study was to isolate the DNA from various plant (tomato) food products, using different types of magnetic particles. The results were compared and the quantity, purity and the possibility of amplication of the isolated DNA among samples were found to be different. The DNA isolation method using magnetic particles P(HEMA-co-GMA) or HPS B-M-NH2 was shown to be the most effective in achieving the above mentiond parametres. DNAs from the analysed samples of plant food products were isolated in sufficient quantity and quality to be used in the conventional PCR. Differences in the possibility of the amplification of the isolated DNA stored at -20 °C during more than a half year were not found.
|
|
|
Srovnání různých typů magnetických nosičů při mikroizolaci DNA z potravin
Koplík, Jerguš ; Lunerová,, Jana (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Byl optimalizován postup mikroizolace DNA v kvalitě pro PCR z vybraných čerstvých a sušených semen luštěnin a potravinových výrobků obsahujících luštěniny (humus). Pro optimalizaci byly použity magnetické mikročástice PGMAox a optimální navážka rostlinných a potravinových materiálů byla zvolena 200 mg. Pro čerstvé rostlinné materiály byl zvolen izolační postup zahrnující použití lyzačního roztoku s CTAB o objemu 500 L, 1 L -merkaptoethanolu a 500 L směsi chloroform-oktanol. Pro izolaci DNA ze sušených semen luštěnin a potravinových výrobků byl navýšen objem lyzačního roztoku s CTAB na 1 000 L. Pro dosažení vyšší čistoty DNA byly některé připravené homogenáty přesráženy isopropylalkoholem. Optimalizovaný proces izolace DNA byl použit při přípravě homogenátu z potravinových výrobků, ze kterých byla izolována DNA různými magnetickými nosiči. Pro srovnání magnetických nosičů byly použity neporézní nosiče poly(glycidylmethakrylát) PGMAox, poly(2-hydroxyethylmethakrylát-co-glycidylmethakrylát) P(HEMA-co-GMA)ox, pokryté karboxylovými skupinami a porézní hypersíťované mikročástice poly(styren-co-divinylbenzen) HPS-B-M-22-NH2, magnetické porézní sklo MPG a nanočástice oxidů železa pokryté poly(L-lysinem) PLL. V průměru nejvyšší koncentrace a nejlepší čistota DNA byla izolována použitím magnetických nosičů P(HEMA-co-GMA)ox a PGMAox.
|
|
|
Změna rychlosti řeči
Kovářík, Aleš ; Schwarz, Petr (oponent) ; Szőke, Igor (vedoucí práce)
Tato diplomová práce pojednává o změně rychlosti řeči. Jako metoda pro změnu rychlosti byla v této práci použita PSOLA (Pitch Synchronous OverLap Add). PSOLA je algoritmus pracující v časové oblasti. Práce rovněž uvádí další metodu -- fázový vokodér pracující ve frekvenční oblasti. Tato práce dále rozšiřuje metodu PSOLA o fonémový rozpoznávač s úmyslem zvýšit srozumitelnost výsledné řeči vyhodnocením typu hlásek v mluveném projevu -- samohlásky, frikativy apod. Pro ověření kvalit navrženého propojení metody PSOLA a fonémového rozpoznávače byla vytvořena aplikace, která toto spojení realizuje.
|
|
|
Příprava vzorků pro analýzu DNA v potravinách rostlinného původu
Silná, Renata ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolace vysoce kvalitní rostlinné DNA je nezbytná pro mnoho aplikací molekulární biologie. Nicméně, rostlinná DNA a potraviny rostlinného původu obsahují velké množství polysacharidů, polyfenolů a jiných sekundárních metabolitů, které snižují výtěžnost a kvalitu izolované DNA. Cílem této diplomové práce byla příprava vzorků a různých potravinových matric pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Jednalo se o 5 druhů zeleniny a 10 druhů různě zpracovaných zeleninových potravinových výrobků. Homogenizace matric byla provedena v CTAB pufru. Izolace rostlinné DNA byla provedena magnetickými částicemi s navázanými karboxylovými skupinami. Veškerá DNA byla izolována v kvalitě vhodné pro konvenční PCR, testována dvěma sadami primerů umožňujících amplifikaci 700 bp amplikonů, u tepelně zpracovaných výrobků na 220 bp a pro PCR v reálném čase. Byla srovnána účinnost separace magnetických částic s navázanou DNA pomocí magnetického separátoru a magnetické jehly. DNA vyšší čistoty byla izolována magnetickou jehlou. Mikrometoda izolace rostlinné DNA z homogenátů s CTAB pomocí magnetických částic je vhodná pro různě zpracované potraviny.
|
|
|
Isolation and detection of DNA from plant species important for food prodution
Orel, Matúš ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
In the food industry, it is very important to take care of the quality, safety and organoleptic properties of the products supplied. For this reason, food must be checked. However, not all information can be found using conventional techniques such as immunoassays, chromatographic techniques, etc. DNA-based techniques can be used for these cases where traditional procedures are insufficient. Among them, the best known technique is PCR. The aim of the thesis was to isolate DNA from vegetable samples (broccoli, beetroot, carrot and pepper). DNA was isolated using the magnetic particle method and the traditional CTAB method. Both methods were able to isolate the DNA from the vegetable samples in quality and at a concentration suitable for PCR, where the 35S rDNA gene region was amplified (more precisely about 700 bp of the 18S-ITS1-5,8S region). After amplification, the PCR products were subjected to restriction reactions and the results compared to bioinformatic analysis. These steps have succeeded in finding suitable enzymes for diferentiation of PCR products from the tested vegetable species.
|
|
|
Evaluation of a micromethod for isolation of DNA from plant leaf, fruit and fruit products
Balažovičová, Nikola ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
The thesis has been focused on testing of micromethod of DNA isolation from leaves, fruits and fruit products. Jams were selected for the analysis of plant DNA in technologically processed foods. Plant leaves, fruits, and jams were homogenized using plastic copist in a lysis buffer containing 2% cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) with 2.5M sodium chloride (NaCl). Microisolation of plant DNA was performed using poly(hydroxyethylmethacrylate-co-glycidylmethacrylate) – P(HEMA-co-GMA)microparticles. Isolated the DNA concentration and purity were assessed by UV light aborbance using a spectrophotometer. After that, amplification of the DNA was tested in PCR. Primers specific for plant ribosomal DNA: 18S_for a 5,8S_rev (PCR product - 700bp), 26S_for a 26S_rev (PCR product - 220 bp), 18S_for a 18¬S_rev (PCR product - 263 bp) were used. The PCR conditions were optimized and the effect of the amplicon length on its detection was followed. PCR products were detected by agarose gel electrophoresis. It was shown that DNA isolated from almost all of leaves using magnetic particles was in PCR-ready quality in contrary to the fruits. DNA amplified in PCR with primers giving short PCR products was isolated from almost all tested jams. The method must be optimalised, yet.
|
|
|
Izolace DNA z vybraných zeleninových výrobků (paprika)
Gőghová, Sabína ; Kuderová,, Alena (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá mikroizolací rostlinné DNA z 10 různých technologicky zpracovaných potravinových výrobků obsahujících papriku (Capsicum annum). DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována z homogenátů připravených v lyzačním roztoku s CTAB pomocí magnetických částic PGMA funkcionalizovaných karboxylovými skupinami. Kvantita a kvalita DNA byla stanovena spektrofotometricky a ověřena metodami PCR s primery specifickými pro rostlinnou rDNA. Kvalita izolované DNA se lišila v závislosti na technologickém zpracování výrobků. DNA izolovaná z uzené mleté papriky a z tepelně ošetřených výrobků (s výjimkou jednoho výrobku) byla degradovaná a amplifikovala se jen s primery F_26S a R_26S (produkt PCR o velikosti 220 bp) na rozdíl od primerů F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700 bp). DNA izolované z dalších potravinových výrobků se amplifikovaly s primery F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700bp). PCR produkt z jedné mleté papriky (Žitavská paprika) byl klonován a sekvencován.
|
|
|
Využití magnetických částic při izolaci DNA z vybraných tepelně zpracovaných výrobků rostlinného původu
Hronová, Aneta ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Diplomová práce byla zaměřena na testování mikroizolace DNA za pomocí magnetických částic z tepelně zpracovaných potravinových výrobků v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Pro analýzu byly vybrány rybízové džemy. Ty byly homogenizovány s použitím plastového kopistu a stomacheru v lyzačním roztoku s cetyltrimetylammonium bromidem (CTAB). Při přípravě homogenátů byl testován vliv chloroform-oktanolu a isopropanolu. Homogenáty byly použity pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Po odstředění komplexů CTAB s proteiny, polyfenoly a polysacharidy byla hrubá frakce DNA purifikována vazbou na magnetické částice. Byly testovány dva druhy magnetických částic: mikročástice poly(hydroxyethylmethakrylát-co-glycidylmethakrylát) - P(HEMA-co-GMA) a nanočástice oxidů železa pokryté poly(L-lysinem) - PLL. Izolovaná DNA byla podrobena spektrofotometrické analýze, kde byla zjišťována její koncentrace a kontaminace polyfenoly a proteiny. Poté byla testována amplifikovatelnost DNA v PCR. Pro amplifikaci byly použity primery specifické pro rostlinnou ribosomální DNA. Produkty PCR s očekávanou délkou 700 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Bylo zjištěno, že z džemů lze pomocí testovaných magnetických nosičů izolovat DNA v kvalitě vhodné pro PCR.
|
|
|
Využití magnetických částic pro izolaci a purifikaci DNA z výrobků pro dětskou výživu
Pešková, Aneta ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolace rostlinné DNA je komplikovaná z důvodu přítomnosti polyfenolů, polysacharidů a dalších metabolitů, které bývají izolovány současně s DNA. Tyto látky mohou mít vliv na výtěžek a kvalitu izolované DNA, a také mohou působit jako inhibitory PCR. Mezi moderní, jednoduché a rychlé metody izolace DNA v molekulárně biologických laboratořích patří magnetická separace, která využívá reverzní imobilizaci DNA na magnetické nosiče a umožňuje získání DNA ve vysoké kvalitě a čistotě. V experimentální části byla provedena mikroizolace rostlinné DNA ze zeleniny (mrkev), ovoce (hruška, jablko, citron, mango) a z tepelně zpracovaných potravinových výrobků pro děti (Hami první mrkvička, Nestlé ovocná kapsička, dmBIO hruška mrkev jablko, Hello ovocná přesnídávka s jablky a Hello ovocná přesnídávka s mangem). K izolaci DNA byly využity magnetické mikročástice PGMA 2 mg/ml a magnetické nanočástice funkcionalizované poly-L-lysinem (PLL) 0,2 mg/ml. Byla porovnána metoda izolace magnetických částic s navázanou DNA magnetickým separátorem a magnetickou jehlou. Kvalita a množství izolované DNA byly zjištěny spektrofotometrickou analýzou a amplifikovatelnost izolované DNA byla ověřena konvenční polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s primery specifickými pro rostlinnou ribosomální DNA (rDNA). Produkty PCR o velikosti 700, 350 a 220 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Z tepelně zpracovaných potravinových výrobků pro děti byla pomocí magnetických nosičů izolována DNA v kvalitě vhodné pro PCR. Detegovány byly však pouze kratší PCR produkty o velikosti 220 bp, což svědčí o degradaci DNA. Specifita PCR produktů byla stanovení analýzou délky restrikčního fragmentu (RFLP). Experimentální výsledky odpovídaly teoretickým výsledkům restrikční analýzy.
|
host ::
RSS.